毕赤酵母PEG1000转化方法

实验概要

本文介绍了毕赤酵母PEG1000转化方法。据称PEG比LiCl 方法好，但不如去壁细胞及电转化法，但对没有电转装置的人来说，更方便，效率为10²-10³/ugDNA。

主要试剂

Buffer A：1M山梨醇，10mM bicine(N－二(羟乙基)甘氨酸)pH8.35，3%(v/v)乙二醇

Buffer B：40%(w/v)聚乙二醇1000，0.2M N－二(羟乙基)甘氨酸pH8.35

Buffer C：0.15M NaCl，10mM N－二(羟乙基)甘氨酸pH8.35

过滤除菌，存于-20 度

新鲜的试剂级DMSO，未打开或刚配制，存于-70 度直至使用。

实验步骤

1. 感受态细胞制备：

   1) 在YPD 平板上划线培养毕赤酵母菌，30 度孵育2天。

   2) 从平板上挑取单克隆于10mlYPD 中，30度振荡过夜。

   3) 早上，在100mlYPD 培养基中接种等量的过夜培养物，至OD600 达0.1，在30 度生长至OD600 为0.5-0.8。

   4) 室温3000g离心收集细胞，用50ml Buffer A洗涤细胞1 次。

   5) 用4ml Buffer A重悬细胞，分成0.2ml 等份分装至1.5ml离心管中，加11ulDMSO于各管中，混合，并在液氮中快速冷冻细胞。

   6) 存于-70度。

2. 转化：

   1) 在<20ul 水中加入50ug DNA，将DNA 直接加入仍处于冰冻状态的感受态细胞管中。载体DNA(40ug 变性及超声处理的鲑鱼精DNA)中加入＜1ug DNA 样品，检测最大转化效率。

   2) 在37 度水浴中孵育各管5min，其间混匀1-2 次。

   3) 取出各管，加入1.5ml Buffer B，完全混匀。

   4) 在30 度水浴中孵育1 小时。

   5) 室温，2000g 离心样品10min，去除上清，用1.5ml Buffer C 重悬细胞。

   6) 再次离心，用0.2ml Buffer C 重悬细胞。

   7) 将管中内容物全部涂在选择生长平板上，30 度孵育3-4 天，筛选Mut 表型，或筛选遗传霉素高抗性克隆。

注意事项

注意，当细胞溶解后，即使放在冰上，其感受性下降都极快，加入DNA于冰冻的管中很关键。可进行多个转化，建议每次转化6个。