灌注固定实验

实验方法原理

实验材料 实验动物

试剂、试剂盒 无水乙醇二甲苯酒精甘油生理盐水等

仪器、耗材 灌注瓶针管剪刀摄子止血钳组织钳咬骨钳等

实验步骤

1灌注固定用1%戊巴比妥钠(80mg/kg)麻醉动物，沿胸骨柄剪开胸腔，剪开心包膜，暴露心脏，与心尖成30°-45°夹角剪开左心室，再剪开右心耳，将灌注针头从左心室插入主动脉，固定针头（图2-I),然灌注固定用1%戊巴比妥钠(80mg/kg)麻醉动物，沿胸骨柄剪开胸腔，剪开心包膜，暴露心脏，与心尖成30°-45°夹角剪开左心室，再剪开右心耳，将灌注针头从左心室插入主动脉，固定针头（图2-I),然后快速用生理盐水冲洗血液，再先快后慢注入固定液灌流固定1.5h（表2-2),如若固定的不理想可将材料取出后固定2-4h(4℃)

2取材动物经过灌注固定后须及时取材，组织所取部位、大小、形状根据实验需求遵循动作轻柔、避免挤压、切片平整、目的组织完整等原则。取出所需组织，放入20%蔗糖液中浸泡(4℃),直至组织完全脱水沉底。

收起 

注意事项

(1)灌流要迅速，生理盐水不宜过多。固定液的灌注要先快后慢，以便充分固定。

(2)固定液总最通常为动物全身血液的2倍左右。

(3)浸泡固定时固定液体积是组织的20倍左右。

(4)取材需谨慎，勿撕扯组织，或用力过猛，造成组织损伤。

(5)戊巴比妥钠、苦味酸等试剂属于毒、麻药品，需专人管理。

其他

其他试剂：①1%戊巴比妥钠溶液(100ml)称取戊巴比妥钠1g,生理盐水100ml,充分溶解(4℃放置）；②0.1mol/L PB缓冲液(1000ml)分别称取KH2P04 13.6g,NaOH 3.20g,加双蒸水至1000ml,调pH至7.4; ③4%多聚甲醛溶液(1000ml)分别称取NaOH 3.20g,多聚甲醛40g,KH2P04 16.80g,蒸馏水溶解，过滤后定容，调pH至7.4(需用搅拌器搅拌，注意添加顺序，前一种完全溶解再加下一种，不需加热可迅速溶解）；④多聚甲醛•戊二醛•苦味酸混合固定液；

(1)固定液的选择很重要，甲醇对抗原保存不理想，乙醇不适合用于T和B细胞抗原固定。

(2)灌流固定是做好免疫组化关键的第一步。生理盐水不宜过多，防止过多引起组织水肿，动物灌流固定结束后，应及时取材(2h内），避免长时间搁置。动物若灌流固定不好，可在取材后再后固定2-4h(4℃)。