相分离过程对细菌功能性淀粉样纤维的形成有重要作用

　　人类文明的发展史就是一部与微生物相爱相杀的斗争史。从1928年开始，以盘尼西林（青霉素）为代表的一系列抗生素的陆续发现，使得很多由病原细菌引发的感染疾病得以成功治疗，人们曾不止一次认为看到了彻底战胜病原细菌的曙光 。然而，几十年来，由于广谱抗生素、抗菌药物的大量使用或滥用，各种耐药性细菌或真菌大量涌现，对全球公共卫生安全构成了巨大挑战。面对微生物的威胁，人类从未停止过斗争。揭示新的耐药机制、寻找新的抗菌靶点成为开发新型抗感染药物的迫切需求。

　　已有研究表明，80%的细菌感染与生物被膜的形成相关。细菌生物被膜是细菌自身分泌的胞外基质相互粘连形成的，具有特定结构和功能的细胞群体。胞外基质的主要成分为胞外多糖、蛋白质、胞外DNA (eDNA) 和脂质等。生物被膜为细菌提供了机械屏障，可以抵御宿主免疫反应并导致细菌对抗生素及消毒剂的敏感性降低，从而增强它们在宿主和环境中的生存能力；此外，生物被膜内部是一种低氧、低pH、高二氧化碳且缺水的干燥环境，营养物质匮乏，不利于细菌生长代谢。传统抗生素可能由于生物被膜的屏障作用和生物被膜内细菌生长代谢改变导致其对成熟生物被膜内的细菌没有作用，生物被膜的形成因而与细菌的耐药性密切相关，也是造成慢性感染和病情迁延不愈的主要原因。

　　近年来，由多重耐药性金黄色葡萄球菌引起的院内感染已对全人类的健康构成极大威胁。全球每年有近100万人死于无法用传统抗生素治疗的细菌感染，其中，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌造成的死亡病例远超过由艾滋病和肺结核引起的死亡病例总和。金黄色葡萄球菌的耐药性往往与其形成生物被膜密切相关。人们很早就在奶牛源金黄色葡萄球菌中发现一种被称作生物被膜相关蛋白（Biofilm associated proteins）的细胞表面蛋白Bap，Bap在介导葡萄球菌生物被膜的形成中发挥重要作用 。Bap是一个多结构域蛋白，全长蛋白含有2276个氨基酸。最近的研究表明，Bap蛋白的N末端在低pH和低钙下易于聚集形成功能性淀粉样纤维，并且促进细菌聚集和生物被膜的形成。然而，Bap蛋白响应环境变化调控淀粉样纤维的形成以及介导生物被膜形成的机制并不清楚。

　　2021年5月28日，清华大学生命学院方显杨课题组在EMBO J杂志发表了题为Structural mechanism for modulation of functional amyloid and biofilm formation by Staphylococcal Bap protein switch 的研究论文。该项工作解析了Bap蛋白N末端BSP结构域的1.9 Å的高分辨率晶体结构，该结构呈现哑铃形折叠，连接N末端和C末端的中间模块（Middle module，MM）由两个串联的全新的钙离子结合基序组成。尽管该基序曾被预测为可结合钙离子的EF-hand，晶体结构表明，不同于传统的EF-hand形成Helix-Loop-Helix的结构并仅结合一个钙离子，该基序形成了Loop-Helix-Loop的结构而且结合两个钙离子，因而是一种全新的钙离子结合基序。小角X射线散射（SAXS），核磁共振（NMR）和分子动力学模拟数据表明，中间模块响应钙离子浓度变化发生从有序到无序的构象转换。体外和体内的生化实验表明，BSP的N端在酸性（pH <= 4.5）条件下通过液相-液相和液相-固相相变形成淀粉样纤维并介导生物被膜形成。该过程受到低钙离子条件下处于无序构象的中间模块（MM）的促进，而钙离子结合可促进中间模块的紧凑折叠，并与周边模块形成相互作用网络，从而抑制相分离发生以及生物被膜的形成。由于许多细菌都通过Bap形成生物被膜，对Bap蛋白介导金黄色葡萄球菌生物被膜形成的调控机制的揭示，有助于开展相关的药物设计。

　　Bap形成淀粉样纤维及介导金黄色葡萄球菌形成生物被膜的调控机制

　　该研究有以下重要发现：

　　1. BSP的N末端包含重复串联的结构模块，可作为支架蛋白介导液液相分离，并通过液固相变聚集为淀粉样纤维。这是迄今为止发现的第一个可经由相分离形成功能性淀粉样纤维的细菌细胞表面蛋白，表明相分离过程在细菌功能性淀粉样纤维的形成过程中发挥重要作用。

　　2. BSP的中间模块作为一种新颖的钙离子结合基序，其结构与近年来在真核和原核生物中发现的多种钙离子结合基序完全不同。中间模块通过感应钙离子和pH的变化而发生“无序↔有序”之间的构象转变，赋予细菌响应外界环境信号并在特殊条件下生存的能力。

　　3. 在低pH和低钙离子浓度条件下，BSP的各结构模块协同性的调控淀粉样纤维的形成进而介导金黄色葡萄球菌生物被膜的形成。

　　清华大学生命学院方显杨助理教授为文章的通讯作者, 2016级博士研究生马俊锋是文章的第一作者，研究助理程翔，2017级博士研究生徐钟河，已毕业博士生张一堪对该课题做出了重要贡献。