碱基编辑技术治疗镰刀细胞贫血病

　　镰状细胞病是一种常染色体隐性遗传病，由 HBB 突变引起，通常编码成人 β-珠蛋白（βA）。尽管同种异体造血干细胞 (HSC) 移植可以治愈 SCD，但通常无法获得最佳匹配的供体，并且该手术可能导致移植排斥或移植物抗宿主病。

　　2021年6月2日，博德研究所David R. Liu（刘如谦）等团队在Nature 在线发表题为“Base editing of haematopoietic stem cells rescues sickle cell disease in mice”的研究论文，该研究使用定制的腺嘌呤碱基编辑器 (ABE8e-NRCH) 将 SCD 等位基因 (HBBS) 转换为Makassar β-珠蛋白 (HBBG)，这是一种非致病性变异 。将编码碱基编辑器和靶向指导 RNA 的 mRNA 离体递送到 SCD 患者的造血干细胞和祖细胞 (HSPC) 中，导致 80% 的 HBBS 转化为 HBBG。将编辑过的人类 HSPC 移植到免疫缺陷小鼠中 16 周后，HBBG 的频率为 68%，缺氧诱导的骨髓网织红细胞镰状细胞减少了 5 倍，表明基因编辑是持久的。

　　为了评估 HBBS 碱基编辑的生理效应，该研究提供了 ABE8e-NRCH 并将 RNA 从人源化 SCD 小鼠导入 HSPC，然后将这些细胞移植到辐射小鼠中。十六周后，Makassar β-珠蛋白占血液中 79% 的 β-珠蛋白，缺氧引起的镰状细胞减少了三倍。与接受未编辑细胞的小鼠相比，接受碱基编辑的 HSPC 的小鼠显示出接近正常的血液学参数和减少的脾脏病理。编辑过的骨髓的二次移植证实了基因编辑在长期造血干细胞中是持久的，并表明 20% 或更多的 HBBS-to-HBBG 编辑足以进行表型拯救。人类 HSPC 的碱基编辑避免了在 Cas9 核酸酶处理后观察到的 p53 激活和更大的缺失。总之，这些发现表明 SCD 的一次性自体治疗可以消除致病性 HBBS，产生良性 HBBG，并最大限度地减少双链 DNA 断裂的不良后果。

　　另外，2021年2月19日，博德研究所刘如谦(David R.Liu)及哈佛医学院Dong Min共同通讯在Science 在线发表题为”Phage-assisted evolution of botulinum neurotoxin proteases with reprogrammed specificity“的研究论文，该研究开发了具有同时阳性和阴性选择的噬菌体辅助蛋白酶进化系统，并将其应用于三种肉毒杆菌神经毒素（BoNT）轻链蛋白酶。该研究将BoNT / X蛋白酶进化为单独的变异体，这些变异体优先裂解囊泡相关膜蛋白4（VAMP4）和Ykt6，进化了BoNT / F蛋白酶以选择性裂解非天然底物VAMP7，并进化了BoNT / E蛋白酶以裂解磷酸酶和肌腱同源蛋白（PTEN），但不是神经元中的任何天然BoNT蛋白酶底物。进化的蛋白酶显示出特异性的大变化（218倍到 11,000,000倍），并且可以保留其形成自我递送至初级神经元的全毒素的能力。这些发现为重新编程蛋白酶建立了通用平台，以选择性地切割具有治疗意义的新靶标（点击阅读）。

　　镰状细胞病是一种常染色体隐性遗传病，由 HBB 突变引起，通常编码成人 β-珠蛋白（βA）。在低氧浓度下，突变型 β-珠蛋白 (βS) 会导致红细胞 (RBC) 内的血红蛋白聚合，从而导致特征性的镰状红细胞以及一系列溶血、炎症和微血管闭塞。症状包括贫血、严重的急性和慢性疼痛、免疫缺陷、多器官衰竭和早逝。尽管同种异体造血干细胞 (HSC) 移植可以治愈 SCD，但通常无法获得最佳匹配的供体，并且该手术可能导致移植排斥或移植物抗宿主病。

　　自体 HSC 的体外修饰以规避 SCD 突变的有害影响是几种实验疗法的基础。已显示出早期临床前景的方法包括通过慢病毒载体异位表达抗镰状 β 样珠蛋白基因 和通过抑制或 Cas9 介导的 BCL11A 破坏诱导胎儿血红蛋白 (HbF)。然而，慢病毒载体存在插入突变的风险，并且可能无法有效抑制病理性βS 的表达。诱导 HbF 表达的基因操作不会消除 βS，并且当由双链 DNA 断裂 (DSB) 介导时，会带来与插入缺失、易位、大染色体片段丢失、染色体碎裂和p53 激活。Cas9 核酸酶介导的同源定向修复可以纠正 HBBS，但很难有效地重新填充 HSC并且还需要 DSB。通过将 HBBS 等位基因转化为良性变异而不引入 DSB 来消除 SCD可以克服这些限制。

　　腺嘌呤碱基编辑器 (ABE) 将活细胞中的目标 A•T 碱基对转化为 G•C，无需 DSB 或供体 DNA 模板，并且插入缺失的形成最少。在 SCD 中，编码 β-珠蛋白第6位氨基酸位置 GAG (Glu) 密码子突变为 GTG (Val)。虽然腺嘌呤碱基编辑不能恢复这种突变，但它可以将致病密码子转化为 GCG (Ala)，从而产生一种天然存在的非致病性变异，称为 Hb-Makassar (HBBG)。

　　该研究生成了一个 ABE (ABE8e-NRCH)，它将 SCD 等位基因转化为非致病性 HBBG Makassar 等位基因，在 SCD 患者的 CD34+ HSPC 中进行最少的非沉默旁观者编辑。经编辑的 HSPC 在植入小鼠后具有持久性，移植后 16 周的 HBBG 频率为 68%，并且衍生的红细胞中镰状细胞显著减少。

　　为了评估表型，该研究从 SCD小鼠模型中编辑了 HSPC，其中内源性 β-珠蛋白基因被人类 HBBS 取代，并将编辑后的 HSPC 移植到受辐射的成年受体小鼠中。编辑后的小鼠 HSPC 的初次和二次移植证实了长期 HSC 中的编辑，并将血液学参数恢复到接近正常水平。这些发现表明，HSC 的自体离体碱基编辑和移植是 SCD 的潜在一次性治疗方法。