磷酸酶制备实验

细胞

缓冲盐清洗液 抽提缓冲液

一、组织/细胞制备和提取

1. 配制下列溶液：

(1) 缓冲盐清洗液：

20 mmol/L 的 MOPS 缓冲液，pH 7.5（配成 100 ml）

5 mmol/L 的 EDTA

5 mmol/L 的 EGTA

120 mmol/L 的 NaCl

(2) 抽提缓冲液

20 mmol/L 的 MOPS，pH 7.5（配成 10 ml）

5 mmol/L EDTA

5 mmol/L EGTA

60 mmol/L 的 β-巯基乙醇 (1:250 原液）

10% 甘油加

新鲜加入的 1 mmol/L PMSF，PMSF 在异丙醇中制成 100 mmol/L 的储存液。

2. 准备细胞或组织

(1) 对于培养细胞

① 除去绝大部分的培养基，直接把培养容器（培养皿或培养瓶）放在冰上以冷却组织培养细胞。

② 用 5 ml 冰冷的缓冲盐洗涤液冲洗培养容器两次，倒掉洗液，加入 1 ml 洗液用橡皮细胞刮把细胞收集到 1 ml 清洗液中。

③ 在一个微型离心机中以 2000 g，离心悬液 2 分钟，收集细胞，倒掉上清。

④ 在 1 ml 的冰冷抽提缓冲液中悬浮沉淀的细胞，然后，在中等强度下超声处理 30 秒。在微型离心机中以 13000 g，将超声物高速离心 5 分钟。

(2) 对于组织样本

① 把切取的动物组织放到塑料袋中，完全浸泡于冰水中彻底冷却样本 5 分钟。

② 用剪刀把组织（1~2 g ) 切成碎片，每克组织混悬于 1 ml 的组织抽提缓冲液中。

③ 用一个 Polytron (Biinkmaim) 或者 Teflon-玻璃匀浆器匀均组织，并且以 13000 g 离心 10 分钟。

3. 保存上清液或细胞浆（第 2 步）作为分离 PP-1 和 PP-2A 的启始材料。用去污剂抽取颗粒部分以分离 PTPase。

二、用连续层析分离 PP-1 和 PP-2A

细胞浆通过 DEAE-Sepharose 以结合 PP-1 和 PP-2A，然后用氨基己基（AH) Sepharose 把 PP-2A 与 PP-1 分离。下面的步骤适合于 0.25 ml 的 DEAE 小珠。

1. 准备层析缓冲液

层析缓冲液：

20 mmoI/L 的 MOPS，pH 7.5 ( 制备 500 ml )

1 mmol/L 的 MgCl₂

60 mmol/L 的 β-巯基乙醇

10% 甘油

2. 用层析缓冲液平衡 DEAE-Seplwose（Phamacia）至 pH 7.5，用洗脱缓冲液（0.5 mol/L 的氯化钠）平衡 AH-Sepharose (Pharmacia)。

3. 在一个有扣盖或螺旋盖的密封小管中将每毫升上清液与 0.25 ml 平衡好的 DEAE-Sepharose 混合，在冰箱中翻转样品液 30 分钟。

4. 准备一个两腔的装置，上层滤膜用来滞留珠状介质，但允许缓冲液在离心过程中穿过，进入底部接收器。

5. —分钟离心沉淀 DEAE，然后用吸管吸出上清弃去。

6. 用 0.5 ml 的层析缓冲液清洗 DEAE 小珠 3 次，用低速离心（2000 r/min) 使液体与小珠分离。

7. 用 0.5 ml 的洗脱缓冲液（0.5 mol/L 的氯化钠）从 DEAE中洗脱磷酸酶，在溶液中悬浮小球，然后在新试管中收集洗脱物。

8. 为了从 PP-2A 中分离 PP-1，把来自于 EDAE 的洗脱液直接与 0.25 ml 的 AH-Sepharose(Phamiacia) 混合，翻转混合 15 分钟。

9. 过滤 AH-Sephrose，从非结合部分回收 PP-1；PP-2 仍结合在 Sepharose 中。

10. 用 1.0 ml 的洗脱缓冲液（0.5 mol/L 的氯化钠）洗涤 AH-Scpharose，用 0.5 ml 洗脱缓冲液（1.5 mol/L 的氯化钠）从 AH-Sepharose 中洗脱 PP-2A。

11. 在 100 ml 量筒中透析含有 PP-2A 的混合洗脱液，透析液用 50 ml 的层析缓冲液（用 2-巯基乙醇制成 150 mmol/L)，加 50 ml 的甘油（保持冰冷浆状），用窄的透析袋（SpectraPor，7.6mm，12000 分子量截留，可从 Fisher、VWR 等供应商处获得），用封口膜封紧量筒，用手慢慢上下转动 15 分钟，然后放许冷处至少 2 小时。