离体线粒体的氧化作用和磷酸化作用实验

测氧仪                                                                  紫外分析仪                                                                  冷冻高速离心机                                                                  血色素吸管                                                                  玻璃管                                                                  层析用玻璃缸                                                                  移液管                                                                  反应瓶                                                                  研钵                                                                  DEAE                                                          

EDTA

2．反应液：

（1）0.1M磷酸缓冲液pH7.0

（2）1.5M蔗糖溶液（25.67g蔗糖用蒸馏水定容为50 ml ）。

（3）ADP（腺二磷）50mg/ ml （50mgADP溶于1 ml 水中）。

（4）CytC（细胞色素C）1mg/ ml （1mgCytC溶于1 ml 水中）。

（5）NAD（氧化辅酶Ⅰ）3.3mg/ ml （3.3mgNAD溶于0.5 ml 水，用NaOH调至pH7.0，再定容为1 ml ）。

（6）CoA（辅酶A）（每支50单位，250单位相当于1mg）。

（7）TPP（焦磷酸硫胺素）50mg/ ml （3.3mgNAD溶于0.5 ml 水，用NaOH调至pH7.0，再定容为1 ml ）。

（8）0.2MMgCl2(2.03gMgCl2·6H2O定容于为50 ml )。

（9）1.1M葡萄糖（10.9葡萄糖加水定容为50 ml ）。

（10）0.1M琥珀酸（0.118g琥珀酸溶于5 ml 水，用NaOH调至pH7.0，再定容为10 ml ）。

3．0.1M丙二酸（pH7.0）

0.017g丙二酸溶于1 ml 水中，用NaOH调至pH7.0，再定容为2 ml 。

4．0.025 N HCl

二、实验步骤

1．线粒体悬浮液的制备

（1）25℃下暗处萌发3－4天的绿豆芽，摘取子叶，去掉下胚轴、根和芽。

（2）取30g子叶、40 ml 提取液和少量石英砂，在研钵中（研钵置于冰盐浴中）快速研磨成匀浆，双层纱布过滤。

（3）滤液于0℃下，3000rpm离心10分钟，弃去沉淀。

（4）上清液于0℃下，12000rpm离心20分钟，弃去上清液。沉淀悬浮于18 ml 提取液中。

（5）上述悬浮液在0℃，12000rpm下离心20分钟，弃去上清液，沉淀悬浮于2 ml 提取液中，即为线粒体悬浮液。保存在冰箱中。

2．仪器安装及耗O2量的测定

反应瓶主室中按下表加入反应液：

如图，安装好测氧仪、氧电极、记录仪。检查仪器是否正常。在侧臂中加入0.5 ml 线粒体悬浮液，插入氧电极，密闭反应瓶，待测氧仪稳定后，将侧臂内线粒体悬浮液轻轻倒入反应室，在磁力搅拌器上搅拌或不断地轻轻摇动反应瓶。20℃下反应10分钟。记录氧分压的变化，由记录曲线比较正常的线粒体和加抑制剂的线粒体耗O2的变化。

测氧装置图

（4）风干后的薄层板在紫外分析灯下观察形成的ATP。

实验记录及报告