科研入门基础实验之qRTPCR

　　这个假期太长，长的我差点忘了自己之前是做啥课题的，直到和某个zz一起玩公众号，商量着Ta负责生信领域，我负责实验部分，各取所长，想想也未尝不可，那就姑且试试吧。

　　接下来我开始用力回忆当初最先学的实验是啥？对，是逆转录定量 PCR（qRT-PCR）！

　　首先来了解qRT-PCR的流程：提取组织/细胞总RNA，以其中的mRNA为模板，利用逆转录酶反转录成cDNA，再进行PCR扩增，通过计算2-ΔΔCt值获得基因表达。归根结底，PCR验证的是基因表达水平。

　　那我们要怎样开始这个实验呢？下面假设我后天就要跑一轮PCR。为什么要后天？因为你明天要提RNA 啊，哈哈。

　　我现在有两个组，对照组和实验组。首先我们要提取RNA和检测RNA浓度。

　　我们都习惯在冰上操作，因为可以防止一部分RNA降解。需要注意的是该过程用到的器械需经灭菌消毒且不能交叉使用，EP管、枪头等也需无菌无核酸酶。佩戴好手套口罩，避免污染。严格按照实验标准操作！

　　然后逆转录。常用的是Takara和罗氏逆转录试剂盒，在这里以比较实惠的Takara试剂盒为例。将1ugRNA根据如下体系（20ul）和程序逆转为cDNA。

　　取出cDNA后加入180ulddH2O于-20℃保存待用。逆转录是傻瓜式操作，按照说明书做就行，没有什么特别容易失误的地方，这里不啰嗦了。

　　最后PCR扩增。

　　取稀释10倍的cDNA2.5ul，荧光染料SYBER Green5ul，浓度为30uM的上下游引物各0.5ul和DEPC水1.5ul，构成10ul体系进行扩增，每个样重复3次。参考基因GAPDH或β-actin，假设有目的基因Kiss1、GPR54、GnRH

　　PS：引物一般通过参考文献或者PrimerBank确定，一定要核对引物来源是否与自己的样本一致（Human、Mouse、Rat.......）

　　数据导入Graphpad Prism作图即可看出与正常组相比，目的基因在实验组的表达情况，再进行统计学分析即可。

　　PCR说简单也简单，说难也难，最主要的还是要细心、耐心。idea可以创新，但是实验方法只有不断地重复。这里只是粗暴的介绍了整个实验流程，让大家稍微有个概念，具体如何操作还是要请教身边的老师和同门，毕竟实验样本诚可贵，可别轻易祸祸了，哈哈。