第二十七期质谱沙龙活动报道

　　2010年6月5日下午，第二十七期质谱沙龙活动在解放军第二炮兵总医院药剂科举行。来自解放军第二炮兵总医院、AB公司、北京师范大学分析测试中心、空军总医院、安贞医院的20余位专家、技术人员参加了此次沙龙活动。

第二十七期质谱沙龙活动现场

 

免疫抑制剂及其合并用药LC-MS/MS高通量检测方法研究

解放军第二炮兵总医院 李鹏飞老师

　　首先，来自解放军第二炮兵总医院的李鹏飞老师通过题为《免疫抑制剂及其合并用药LC-MS/MS高通量检测方法研究》的报告，向大家介绍了最近备受关注的使用液质联用技术进行免疫制剂方面的实验。李老师主要从事他克莫司免疫制剂的研究，包括开发他克莫司检测试剂盒。

　　李老师首先介绍了一下免疫抑制剂的研究背景。上世纪90年代比较注重的治疗药物监测(TDM)和60年代开始在临床应用的器官移植，都不同程度的促进免疫抑制剂的发展。而LC-MS/MS高通量能同时检测免疫抑制剂及合并用药在人血中的浓度，因此它的研究日益得到重视。

　　治疗药物监测(TDM)是对治疗指数窄、毒性作用强、个体差异大的药物，测定其血液或其他体液中的药物浓度，根据药动学原理制定个体给药方案。TDM药物的特点：安全范围窄，治疗浓度范围与中毒浓度很接近；无明显的、可观察的治疗终点或指标；剂量、药物作用之间的关系不可知；药物中毒与无效时均很危险等。器官移植成为21世纪医学发展的主要方向之一。免疫抑制剂作为器官移植学三大支柱之一，是器官移植成败的关键。目前在临床实践中实体器官移植尚不能彻底停用免疫抑制剂，因此器官移植依然处于免疫抑制剂时代，免疫抑制剂的长期应用及其不良反应的控制仍是临床移植医学研究的重点。常用的免疫抑制剂有：环孢素A(CsA)、他克莫司(FK506)、霉酚酸酯(MMF)、肾上腺糖皮质激素硫唑嘌呤。

　　LC-MS/MS高通量的意义在于能提供免疫抑制剂及合并用药的血药浓度，为临床个体化给药提供依据，为进一步验证或确认药物之间的相互作用提供方法支持，都是更好地为临床服务。

　　在实验中，李老师采用了3200QTrap型液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子源(ESI)以及Analyst1.4.2数据处理软件，和Agilent1100高效液相色谱系统等仪器。该试验分为五个阶段：第一阶段：建立拟测定药物各自的质谱条件；第二阶段：建立同时检测多种药物浓度的色谱条件；第三阶段：建立同时检测样本的前处理方法；第四阶段：定量分析方法的验证；第五阶段：用建立的检测方法检测未知生物样本。以下为上述五个阶段的分析方法：

　　第一阶段，建立拟测定药物各自的质谱条件。通过储备液配置，蠕动泵模式进样，找到各自优化条件；

　　第二阶段，建立同时检测多种药物浓度的色谱条件。包括流动相组成、色谱柱、流动相随时间变化(梯度)、柱温、进样量；

　　第三阶段，样品前处理及内标选择。生物样品前处理方法包括沉淀蛋白法、固相萃取法、液-液萃取法和固相微萃取法。内标的选择包括有1-2中不常用药物、1种非药物以及同位素内标这三种不同的选择，李老师在试验中选择沉淀蛋白法(甲醇)和1-2种不常用药物(替米沙坦)的内标法。

　　第四阶段，定量分析方法的验证。其中包括验证方法的专属性，标准曲线与线性范围，精密度与准确度试验，提取回收率和基质效应以及稳定性试验。

　　第五阶段，检测实际样本中，李老师采用二炮医院服用免疫抑制剂患者血浆样本30例检测结果，以及朝阳医院肾移植患者全血样本192例检测结果进行比较，得出比较可靠的结果。

　　在试验过程中，李老师也遇到了一些问题。比如，使用霉酚酸做试验时，由于标准样和实际样存在差异，血浆和全血中浓度可能不同。奥美拉唑和尼卡地平响应值太高，在高浓度值处接近质谱仪响应的上限，故响应与浓度不成比例，导致检测偏差较大等。

　　最后，李老师得出的结论为在《免疫抑制剂及其合并用药LC-MS/MS高通量检测方法研究》的课题中，采用LC-MS/MS高通量检测方法快速、灵敏，专属性强、重现性好，可以用于人体血浆中硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、地塞米松、奥美拉唑、地尔硫卓、尼卡地平、非洛地平、霉酚酸的浓度测定。因此，在免疫抑制剂及其合并药的研究中越来越受到重视。

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混合炸药种类识别及溯源方法研究

北京师范大学分析测试中心 田菲菲老师

　　来自北京师范大学分析测试中心的田菲菲老师为大家带来了题为《混合炸药种类识别及溯源方法研究》的报告。

　　研究意义

　　2004年7月，大兴安岭地区某居民楼一房门被炸，在现场提取到少许未燃尽的炸药残留物。用气相色谱和离子色谱技术进行分析，检测出TNT和硝酸铵混合炸药，为侦破案件提供了重要的线索。因此，田老师指出掌握爆炸案件现场爆炸残留物的检验方法，对于严厉打击利用爆炸进行的犯罪活动有着十分重要的意义。

　　炸药成分

　　田老师指出乳化炸药、铵油炸药和铵锑炸药是目前我国工业炸药中使用最为广泛的三种。这三种炸药的主要成为都均为硝酸铵(占到90%以上)，其余非爆炸成分包括有碳质燃料组分、油包水乳化剂、敏化剂、柴油等。所以在爆炸残留物中只检测硝酸铵是不能判断炸药的种类的，如能够检测到这些非爆炸成分，便能够为公安部门提供更好的线索和依据。

　　国内外研究现状

　　目前对炸药的研究主要分为两大方面，一是爆炸前对炸药的探测；二是爆炸残留物分析方法的研究。其中分析方法包括有化学方法和色谱方法这两大类。其中化学方法主要为操作简单的点滴反映法和显色法这两种，该方法易收到环境的干扰。

　　色谱方法则被认为是鉴定爆炸残留物最为常用的方法，包括有气相色谱、液相色谱、离子色谱和质谱法。如果能从爆炸残留物中分离出各组分的成分，从而便能判定出爆炸物的种类。目前，对工业炸药的研究集中在其主要成分硝酸铵的检测上，对非炸药成分的分析鲜有报道。

 

　　研究工作

　　田老师指出其研究工作重点为炸药种类的识别及其溯源。其中种类识别主要依据非炸药成分之间的差异，溯源研究即为从对爆炸残留物的检测鉴定出爆炸物的原料成分。田老师的研究工作分为两大部分，第一大部分为对收集到的77种工业炸药中的非炸药成分进行分析，从而得到各种炸药的特征成分；第二大部分为模拟爆炸现场，找到爆炸残留物的特征与爆炸物之间的特征进行比对分析，实现溯源的研究，从而验证该实验方法的可行性。

　　炸药中常用的非炸药成分主要包括碳质燃料组分(石蜡、地蜡、混合蜡、柴油、松香)和乳化剂，通过对非炸药组分的检验可以实现炸药种类的识别。从常见碳质燃料的气相色谱质谱图上可以看到，石蜡、地蜡、混合蜡、柴油的色谱特征都是一系列成高低分布的正构烷烃，松香的特征成分为单萜类物质和树脂酸。

　　结合上述碳质燃料的分析结果，田老师对77种工业炸药的碳质燃料进行分析，结果发现铵锑炸药中的碳质燃料属于蜡类，铵油炸药的碳质燃料属于柴油，粉状乳化炸药的碳质燃料属于松香和蜡类、乳状乳化炸药的碳质燃料属于蜡类。以上这几类炸药中的碳质燃料成分十分相近，因此不能作为个体识别的依据。

　　乳状乳化炸药的个体识别

　　接下来，田老师继续对乳化剂Span-80进行分析，乳化剂Span-80是乳化炸药的关键组分，它是由山梨醇失水生成山梨醇酐，再与油酸发生酯化反应生成的混合物。通过乳化剂Span-80的电喷雾质谱图可以看到，乳化剂Span-80名义上是山梨醇酐单油酸酯，但实际上含有单酯、双酯、三酯及未反应完全的油酸、山梨醇酐及其同分异构体组成。乳化剂Span-80属于非离子型表面活性剂，不能直接采用气质联用的方法进行检测。于是，田老师对这些单酯、双酯及其同分异构体进行酯化反应，使其生成山梨醇和一些易于进行气质联用仪检测的油酸甲酯类物质。

　　从乳化剂Span-80酯交换衍生产物的GC/MS图中得到，该产物不仅含有硫酸甲酯还包括亚硫酸甲酯和蜡类，并且不同品牌之间的乳化剂Span-80的酯交换衍生产物的相对含量存在很大的差异，因此可以根据这些差异作为乳化炸药个体识别的依据。田老师通过酯交换GC/MS方法对24种乳化炸药进行了分析，根据乳化炸药中乳化剂酯交换衍生产物相对含量的差异，从而实现了24种乳化炸药的个体识别。该方法为研究乳状乳化炸药残留物的种类识别提供了理论依据。

 

　　乳状乳化炸药的溯源研究

　　田老师采用GC/MS方法对空白尘土和乳化炸药的酯交换衍生产物进行分析，发现在空白尘土中也检测出硫酸甲酯，即存在很大的环境干扰，经分析得知环境中常见的一些油脂及动植物的残骸通过酯交换衍生也能生成油酸甲酯等物质，说明该方法不适合复杂爆炸残留物中乳化炸药的分析。

　　乳化剂Span-80通过酯交换主要生成油酸甲酯和山梨醇，而环境中很少存在山梨醇的干扰，因此田老师希望通过对山梨醇的分析，来实现乳状乳化炸药的溯源。首先对山梨醇进行乙酰化和硅烷化衍生处理，得到其衍生产物，希望建立一种选择性好、灵敏度高、适合复杂残留物中痕量乳化剂的分析方法。

　　酯交换乙酰化衍生方法

　　乳化剂Span-80酯交换、乙酰化的衍生产物包括1,4,3,6山梨醇乙酸酯、1,4山梨醇乙酸酯和1,5山梨醇乙酸酯及其同分异构体，以及山梨醇乙酸酯、油酸甲酯等成分。但从山梨醇乙酰化的质谱图中看到，上述这些衍生产物的碎片信息较少且灵敏度低，因此不适合检测复杂基质中的痕量乳化剂。

　　酯交换硅烷化衍生方法

　　乳化剂Span-80经过酯交换、硅烷化衍生处理之后，产物包括1,4,3,6山梨醇硅烷酯、1,4山梨醇硅烷酯和1,5山梨醇硅烷酯及其同分异构体，以及山梨醇硅烷酯、油酸甲酯、油酸硅烷酯等成分。同样，从山梨醇硅烷化的质谱图中看到碎片离子信息强，适合采用GC/MS联用和离子模式进行检测。

　　从空白尘土与乳化炸药酯交换、硅烷化衍生产物的GC-MS-SIM的色谱图中发现，乳化炸药的特征成分为1,4,3,6山梨醇硅烷酯、1,4山梨醇硅烷酯、1,5山梨醇硅烷酯及其同分异构体，以及山梨醇硅烷酯、油酸甲酯、油酸硅烷酯。而在空白尘土中仅仅检测到硫酸甲酯的成分，没有任何源于山梨醇硅烷酯的成分在内，从而验证环境中不存在山梨醇硅烷酯的干扰，因此选定该产物作为乳化炸药鉴定的依据。接下来，田老师为提高检测灵敏度，采用SIM模式对山梨醇硅烷酯进行检测，在不同药量的残留物种均检测到较大强度的山梨醇硅烷酯类物质，从而实现了溯源。

　　研究结果系显示乳化剂经过酯交换、硅烷化衍生得到的衍生产物具有灵敏度高、选择性强的优点，且能排除环境的干扰；在乳化炸药原药及其300g、600g药量残留物中均检测到山梨醇硅烷酯、油酸甲酯和复合蜡等特征成分，能够实现炸药的溯源，也验证了该方法的可行性，为炸药种类的溯源判定提供了有力的科学依据。

　　本网收录前沿Lab：北京师范大学分析测试中心

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液相色谱的基础

AB公司 赵贵平博士

　　AB公司的赵贵平博士从液相色谱的基础知识、实验技术、色谱柱的选择、色谱柱的使用及保养、方法开发5个方面介绍了液相色谱。赵博士的报告对于色谱的初学者是一次很好的知识普及，对于色谱的使用者则是一次经验的共享。

　　基础知识介绍

　　赵博士介绍，色谱作为一种常用的分离方式，20世纪30年代开始广泛应用和研究。液相色谱的发展经历了柱色谱、纸色谱、薄层色谱发展到高效液相色谱的历程。高效液相色谱是一种区别于经典液相色谱，基于仪器方法的高效能分离手段，具有高性能色谱柱、高精度输液泵、高灵敏度检测器… 但是，无论在技术上，理论上，还是在应用上仍处于发展阶段。

　　如果要开发液相色谱方法，需要考虑因素主要因素就是分离度，其次还应该考虑灵敏度、载样量、分析速度、溶剂损耗，再次需要考虑成本、操作性、色谱柱寿命、效率。

　　液相色谱的结果就是色谱图，此部分中，赵博士对色谱图的相关术语也做了介绍。重点介绍了色谱图常见的问题。这主要涉及色谱峰峰形异常问题(如负峰、宽峰、肩峰、双峰、峰形不对称等)和色谱峰保留时间问题(如保留时间不稳定等)两方面。

 

　　HPLC的实验技术

　　这部分中，赵博士讲了液相色谱实验中对流动相的要求、流动相的脱气及保存、色谱泵的运行及保养、样品预处理、色谱系统管路联接几个方面的问题。其中，赵博士重点介绍了流动相的脱气、色谱系统的管路联接以及故障与排除三个方面：

　　1)流动相的脱气

　　流动相脱气的目的是为了使色谱泵的输液准确脉动减小，保留时间及色谱峰面积的重现性提高。

　　2)色谱系统的管路连接

　　管路连接不恰当会造成柱外(未连接色谱柱)谱带扩展，色谱峰之所以表现为谱带就是由于扩散造成的。影响谱带扩展的因素有进样体积、进样器(密封问题)、连接管路、进样器到色谱柱、色谱柱到检测器、接头和筛板、检测器体积、以及色谱柱的填料空隙和筛板堵塞等。

　　3)判断故障与故障排除的原则

　　规则一∶确认问题至少发生两次以上。如果问题不重复出现，很难证实其确实存在。

　　规则二∶从最简单的因素入手。

　　规则三∶一次只变化一个因素，以使你能够确认所变因素与问题之间的关联。

　　规则四∶恢复原状，如果使用更换组件方法来查找问题之所在,完毕后应将原有完好组件安装回原处。

　　否则，换下的组件将来很难再利用,会造成浪费。

　　规则五∶养成记录的好习惯。一个好记录是成功地进行故障排除的关键。

 

　　液相色谱柱的选择

　　赵博士讲到，选择液相色谱柱即为选择填料。具体与填料的粒径、键合化学、填料的含碳量、硅胶的活性有关。

　　填料颗粒度越小，柱效越高(传质好，涡流扩散小)、柱压越高(渗透性差)；颗粒分布越宽，柱效低(渗透性差)；球型颗粒柱效高、重现性好、柱床结构均匀，无定型颗粒柱床结构不均匀，流动相线性速度不匀、流动相线性速度不均匀、谱带扩展。

　　不同键合相对不同种类的化合物分离不同，可能导致色谱的分离机理不同。

　　高含碳量有利于不易保留的化合物的分离，水解稳定性好，重现性好，有利于极性化合物的拖尾改善；低含碳量有利于分析中性及碱性化合物，降低溶剂损耗。

　　硅胶活性的不同是由于生产硅胶时处理温度不同造成的，这是选择性差异的主要来源；硅胶的杂质含量是色谱柱质量好坏的重要标志，重金属含量低，硅羟基活性小，拖尾减小。

 

　　液相色谱柱的使用及保养

　　赵博士介绍，拿到一根新色谱柱时，要先测柱效，这是良好的色谱实验习惯。还要保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录色谱测试条件。此外，还应定期检测柱效和仪器的谱带展宽。赵博士同时提醒大家，对于一根从未用过的色谱柱时，一定要先看其使用说明!

　　对于反相色谱柱，当使用纯水溶液流动相是，会出现不保留分离组分的“疏水塌陷”现象。

　　想要解决这一问题，赵博士介绍了相应的对策：对于一般的C18或C8反相柱，应尽量避免；使用纯水溶液流动相时，修复已出现疏水塌陷的反相柱，须先用纯水洗净柱中的水溶性缓冲盐，再用纯甲醇小流速浸润色谱柱。

 

　　液相色谱方法开发

　　这部分中，赵博士就液相色谱新方法的开发与大家进行了交流。要开发一个新的色谱方法，应该从参考文献方法或执行法规方法、选择色谱柱、梯度方法初步三个方面考虑。

　　第一步就是要想办法得到各种信息，可以通过以下途径：向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法；查文献，如CA等。其次，是要对色谱柱有足够的了解，即掌握分离机理，充分了解要分析测定的样品及基质。

　　色谱柱是开发液相色谱方法的基础，色谱柱种类繁多，性能各异，赵博士表示，只有选择性不同的色谱柱，没有所谓的坏色谱柱。选择色谱柱的首要原则是适用于分析对象,因为，没有万能的色谱柱!

　　梯度洗脱可以增加单位时间的分离能力，提高检测灵敏度。但是，这对仪器设备要求高，且色谱柱需再生，定量分析的重复性较低。

梯度洗脱的方式

　　报告下载：液相色谱基础