纳米药物的表征和质量控制（二）

透射电子显微镜法（TEM法）

透射电子显微镜法是粒子粒径分析最常用的方法之一，透射电子显微镜可观察和表征纳米粒子的形貌和测定粒径大小。测定时，将纳米粒子制成悬浮液并滴在带碳支持膜的铜网上，待载液如乙醇挥发后，放入样品台。每种纳米粒子分别选有代表性的A、B和C三组纳米群拍摄高倍电镜像，每张照片中随机选取一定数量的（如50颗粒）纳米粒子测量粒径，按下列公式计算得出平均粒径。

原子力学显微镜法

纳米技术的诞生是以扫描隧道电子显微镜（Scanning tunneling microscopy，STM）和原子力显微镜（atomic force microscopy，AFM）的发明为先导的。近年来，原子力显微镜在生物医学领域越来越广泛，与光学显微镜相比，其优点在于分辨率大大提高，可以达到纳米级。与电镜相比，它可以在生理状态下成像，比电镜需要的真空环境方便了许多；样品制备时间短，且易操作。有人用原子力显微镜（AFM）作为主要表征手段观察液体纳米药物的颗粒大小及形貌特征，为液体纳米药物在生理状态下的研究提供实验依据。

X射线衍射线线宽法（谢乐法）

使用多晶X射线衍射仪测定纳米粒子的晶体结构和平均粒径大小，根据谢乐的微晶尺度计算公式，计算纳米粒子的平均粒径

式中，λ=0. 154 059nm，为X射线的波长（Cu靶），βHKL=?–?O，为衍射线半高峰强度处因晶粒度细化引起的宽化度，?，?O分别为实测半高峰宽和仪器宽化度（通过测量粒径>1μm标准物而得）。

在测定中选取4条低角度（2θ≤50）X射线衍射线计算纳米粒子的平均粒径。

其他方法

现有粒度分析的方法很多，同一样品用不同的方法得到的粒径的物理意义乃至粒径大小也有所不同；因此，应根据被测对象种类、测量准确度和测量精度的要求等选择合适的方法。目前，除以上介绍的几种外，还有其他一些方法如紫外-可见分光光度法、毛细管区带电泳法等。

药物载体的包封率

包封率是评价纳米微囊、微球及脂质体等剂型质量和工艺优劣的重要指标，中国药典2010年版（二部） 附录ⅪX E 微囊、微球及脂质体制剂指导原则中规定：若得到的是分散在液体介质中的微囊、微球、脂质体，应通过适当方法（如凝胶柱色谱法、离心法或透析法）进行分离后测定，即先用一定的方法把未包封的游离药物与微囊、微球或脂质体分离开并测定后，根据总投药量计算包封率。或分离后测定包封（脂质体）的药物量与磷脂的比例，计算药脂比。

分子排阻色谱法

又称凝胶色谱法，是利用脂质体与游离药物分子质量和粒径大小的差异进行分离，脂质体粒径较大先被洗脱，游离的药物粒径较小后被洗脱从而达到分离效果，常用的分离介质是葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶。基本方法是先将溶胀好的凝胶装入柱子中，用洗脱液冲洗柱子至平衡后，将脂质体上柱，洗脱。

微柱离心法

微柱离心法可快速、简便分离脂质体内外相药物，所需样品量小，且几乎不影响原来样品性质与状态的脂质体包封率测定，尤其适用于一些中间过程的检测，如药物释放过程、主动载药过程，其优点是在最初的离心中已除去增加脂质体体积的过量空白溶液，因此不经稀释即可重新得到脂质体，需注意的是，该法是建立于脂质体不被填充物物理滞留的假设之上，应事先检验该假设。

透析法

透析法是把药物放入一定截留分子量的透析袋中，再把透析袋置于比其体积大许多倍的透析介质中，游离药物顺浓度梯度从透析袋内渗透到透析袋外，而脂质体由于粒径较大而不能渗透到外部介质里，然后在不同的时间测定介质中的药物浓度，直至外部介质中的药物浓度不变，说明透析袋内外游离药物的浓度相同且达到平衡，此时的时间作为游离药物透析平衡时间，测出此时介质中的药物浓度计算游离药物的浓度，进而计算出包封率。

离心法

根据脂质体与游离药物比重不同所受到的离心力不同，从而沉降速度不同，达到分离的目的，用来测定包封率。用离心法测定包封率可分为低速离心、超速离心和超滤离心等。如果脂质体与游离药物的粒径大小无重叠，可以用超滤离心法分离, 超滤离心法很适用于分离水溶性药物。

离子交换色谱法

离子交换色谱法是根据游离药物与脂质体所带电荷的不同而分离。Amselem S等将阳离子交换树脂加入到所制备的脂质体中，室温振摇20 min，未包封的阿霉素带正电荷，结合到阳离子交换树脂上，脂质体带负电荷不与阳离子交换树脂结合，过滤混合的脂质体和阳离子交换树脂使两者分离，从而得到去除游离药物的脂质体。

NMR法

Zhang XM等建立了测定脂质体包封率的NMR法，在跨膜pH梯度的存在下，用pH敏感的质子化学漂移试剂做标记物，通过调节脂质体外相介质的pH，利用不同pH值下的游离药物和包封的药物的共振信号的位移不同，来识别脂质体包封和未包封的药物峰，测定脂质体的包封率。测定过程不需要物理分离，是一种测定脂质体包封率快捷简便的方法。

荧光淬灭反应法

荧光淬灭法指具有荧光的物质如钙黄绿素、羧基荧光素等水溶性荧光物质或者具有荧光的药物，在高浓度时发生自淬灭，在某一低浓度范围内，荧光强度又和浓度成正比。高浓度时包封于脂质体内水相中，然后高度稀释于分散介质中，这时包封在脂质体内水相中的荧光物质保持自淬灭无荧光产生，而未包封在脂质体外的水相中浓度降低荧光重现，加入破膜液后，脂质体的内水相中荧光物质释放，稀释到适当浓度发出荧光，通过荧光检测器测定荧光值，准确测定最初脂质体包封和未包封的荧光物质浓度计算得到包封率。此方法意不需要分离脂质体和游离药物，直接测定药物的包封率，快速、准确，避免了分离带来的误差。

电子自旋共振光谱法

电子自旋共振光谱法也被用于包封率的测定，当添加顺磁性试剂如铁氢化物时，外部标记物的电子自旋谱带会显著加宽；还可以利用包裹在脂质体内部的标记物与游离标记物间扩散系数的不同来测定包封率。

鱼精蛋白凝聚法

将一定量的脂质体和鱼精蛋白溶液快速混和，脂质体与鱼精蛋白产生凝聚，通过过滤或离心，分离上清液（或滤液）和凝聚物，测出上清液（或滤液）中的药物浓度为游离药物的浓度，聚集物中的药物浓度为包在脂质体中的药物浓度，计算包封率。