细胞凋亡检测

实验概要

细胞凋亡是细胞生物学研究的重要领域。检测药物或某种处理对于细胞细胞的影响时，细胞凋亡检测是一个重要检测指标。以Annexin V联合PI法为例简述细胞凋亡检测。

实验原理

在细胞凋亡早期，位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）迁移至细胞膜外侧。磷脂结合蛋白V（Annexin V）是钙依赖性的磷脂结合蛋白，它与PS具有高度的结合力。因此，Annexin V可以作为探针检测暴露在细胞外侧的PS，将Annexin V标记上荧光素（如异硫氰酸荧光素FITC），同时结合使用PI拒染法（因坏死细胞PS亦暴露于细胞膜外侧，且对PI高染）进行凋亡细胞双染法后用流式细胞仪即可检测凋亡细胞。正常活细胞Annexin V和PI均低染；凋亡细胞Annexin V高染，PI低染；坏死细胞Annexin V和PI均高染。

主要试剂

0.25%Trypsin、细胞基础培养液、DPBS（4℃预冷）、Annexin V-eGFP、100 μg/mL PI、10×Binding Buffer、1×Binding Buffer

主要设备

流式管

实验步骤

（1）收集细胞
收集悬浮细胞培养液至15 mL离心管，2000 r/min离心5min，弃上清。
贴壁细胞用0.25%Trypsin消化后，加入等体积细胞基础培养液终止反应，收集细胞悬液至15 mL离心管，2000 r/min离心5min，弃上清。
注意：Trypsin消化时间不宜过长，以防引起假阳性。
（2）加入4℃预冷的DPBS重悬细胞，2000 r/min离心5min，弃上清。
（3）重复第（2）步一次。
（4）用400μL 1×Binding Buffer悬浮细胞，浓度大约为1×10⁶细胞/mL。
（5）在细胞悬浮液中加入5μL Annexin V-eGFP，轻轻混匀后于2～8°C避光条件下孵育15 min。
（6）加入10μL100 μg/mLPI后轻轻混匀，于2～8°C避光条件下孵育5 min。
（6）在1 h内用流式细胞仪或荧光显微镜检测，以绿色荧光为横轴，PI的红色荧光为纵轴作图，左下象限的细胞群为正常细胞，右上象限的细胞群为凋亡细胞。
 
注意：

1. 操作过程要轻柔，不可用力吹打细胞；
   

2. 实验操作完成后尽快进行分析，避免荧光随着时间延长而淬灭；
   

3. 双染需要流式细胞仪调节荧光补偿，所以需要各种荧光单染的细胞作为对照。