细胞核与线粒体的分级分离

一、所需试剂及设备

小白鼠、冰块、玻璃匀浆器、普通离心机、台式高速离心机、普通天平、光学显微镜、载玻片、盖玻片、刻度离心管、高速离心管、滴管、10ml量筒、25m1烧杯、玻璃漏斗、解剖剪、镊子、吸水纸、纱布、蜡盘、平皿、牙签。0.25moL/L蔗糖一0.003mol/L CaCl2溶液、1%甲苯胺兰染液、0.02%詹纳斯绿B染液、0.9%NaCl溶液。

附:溶液的配制：
1/300詹纳斯绿染液：
取詹纳斯绿1克，加Riger氏液300ml。现用现配。
1/3000中性红染液：
称取中性红 (Neutral red)O.1g，加蒸馏水300ml。室温保存.
Ringer Solution：
NaCl 0.9g
KCl 0.042g
CaCl2 0.025g
蒸馏水 100m1
0.25mol/L蔗糖一0.003mom/L氯化钙溶液：
蔗糖 85.5g
CaCl2 0.33g
蒸馏水 1000ml

二、操作步骤

（一）制备肝细胞匀浆
将小白鼠用颈椎脱位法处死，迅速开腹取肝，剪成小块(去除结缔组织)尽快置于盛有0.9%NaCl的烧杯中，反复洗涤，除去血污，用滤纸吸去表面的液体。
称取1g肝组织(湿重)放在小平皿中，用量筒量取8ml预冷的0.25moL/L蔗糖—0.003mol/L CaCl2溶液，先加少量该溶液于平皿中，尽量剪碎肝组织后，再全加入。剪碎的肝组织倒入匀浆管中，使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿中，左手持之，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨3一5次，用8层纱布 (先用蔗糖液湿润)过滤匀浆于离心管中，然后制备涂片①，做好标记，自然干燥。

（二）分级分离与观察
1. 细胞核的分离提取与观察
将装有滤液的离心管配平后，放入普通离心机，以2500rpm，离心15min；缓缓取上清液，移入高速离心管中，放在冰块中，待分离线粒体用；同时涂一张上清液片②，做好标记，自然干燥；余下的沉淀物进行下一步骤。
用6m1蔗糖一氯化钙溶液悬浮沉淀物，以250Orpm离心15min弃上清，将残留液体用吸管吹打成悬液，滴一滴于干净的载片上，即涂片③，自然干燥。
将涂片①②③用1%甲苯胺兰染色后盖片即可观察。
2. 线粒体的分离提取与观察
将上述装有上清液的高速离心管，从装有冰块的烧杯中取出，配平后，以17000rpm离心20min，弃上清，留取沉淀物。加入0.25moL/L蔗糖—0.003mol/L氯化钙溶液1m1，用吸管吹打成悬液，以17000rpm离心20min，将上清吸入另一试管中，留取沉淀物，加入蔗糖一氯化钙溶液0.1ml混匀成悬液(可用牙签)。取上清液和沉淀悬液，分别滴一滴于干净载玻片上(分别标记④⑤涂片)，各滴一滴0.02%詹纳斯绿B染液盖上盖片染色20min。
油镜下观察，颗粒状的线粒体被詹纳斯绿B染成蓝绿色。