细胞质RNA提取实验

实验材料 RNA

试剂、试剂盒 PBS细胞裂解液SDS蛋白酶K酚氯仿异戊醇无水乙醇

仪器、耗材 离心机培养箱

实验步骤

1.  对于单层培奍细胞

（1）每10 cm 培养皿培养的细胞，用冰冷PBS洗涤3次。

（2）每次1 ml 然后用小体积PBS刮下细胞，转移至冰浴的离心管中。

（3）300 g 离心5 min，弃上清，继续冰浴。

2.  对于悬浮培养细胞

（1）300 g 离心5 min，弃上请。

（2）细胞以1/2原体积的冰冷重悬，再离心后弃上清。

3.  重悬细胞于375 μl  冰冷的细胞裂解缓冲液，并置冰浴5 min。

4.  于4℃在微量离心机中离心2 min，将上清移至一个洁净的已加有5 μl 20%SDS的管中，立即在旋涡混合器上振荡。

5.  加入2.5 μl 20 mg/ml 蛋白酶K，37℃温育15 min。

6.  加入400 μl 酚/氯仿/异戊醇抽提，在旋涡混合器上振荡用微量离心机离心，上清移至干净的离心管中，重复抽提1遍。

7.  再以400 μl 氯仿/异戊醇抽棰，上层水相转移至干净的离心管中。

8.  加入40 μl 3 mol/l 乙酸钠缓冲液（pH7.5），再加无水乙醇，混匀后在干冰/乙醇中沉淀15~30 min或-20℃过夜。

9.  用微量离心机4℃离心15 min 加人1 ml 75%乙醇/25% 0.1 mol/l乙酸钠（pH5.2）冼涤沉淀。

10.  干燥后用100 μl 处理过的水重溶沉淀，取10 μl RNA稀释于1 ml 水中，测A280和A260，其与的RNA可在-70℃贮存。