细菌人工染色体的应用

限制性内切核酸酶 大肠杆菌培养物 电转感受态大肠杆菌细胞

LB 冷冻缓冲液

脉冲场凝胶电泳仪 LB 琼脂平板 LB 培养基 电穿孔仪

一、材料

1. 缓冲液与溶液

LB 冷冻缓冲液

2. 酶与缓冲液

限制性内切核酸酶

3. 凝胶

脉冲场凝胶电泳仪

4. 培养基

含 12.5 μg/ml 氯霉素的 LB 琼脂平板

含 12.5 μg/ml 氯霉素的 LB 培养基

5. 专用设备

电穿孔仪

6. 载体与菌株

BAC DNA 或 BAC 分离物转化的大肠杆菌培养物

冷冻的电转感受态大肠杆菌细胞

二、方法

1. 制备新鲜的 BAC 转化子。

(1) 如果 BAC 是以 DNA 的形式提供的

① 用电穿孔法将 BAC DNA 导入大肠杆菌（DH10B 菌株）中。

② 从每批电穿孔后的菌液分别取出 2.5、25 和 250 μl，涂布于含 12.5 μg/ml 氯霉素的 LB 琼脂平板上。37℃ 温育平板 16~24 h。

(2) 如果 BAC 是以转化菌液的形式提供的

① 立即在含 12.5 μg/ml 氯霉素的 LB 琼脂平板上划线培养。

② 37℃ 温育 12~16 h。

2. 挑选 12 个转化菌落，分别加入 5 ml 含 12.5 μg/ml 氯霉素的 LB 培养基中。37℃ 剧烈振摇过夜。

3. 在每 12 管 5 ml 培养液中各取 1 菌环，分别接种于 LB 冷冻培养基中培养。待细菌生长后，转移至 -20℃ 冷冻保存。

4. 从步骤 2 每个 5 ml 菌液中取 4.5 ml，纯化 BAC DNA。

5. 分析 BAC DNA

(1) 用 PCR 法或用 SouAem 杂交鉴定 BAC 含有染色体的目的区域。

(2) 用限制酶切和 PFGE 检测插入片段的大小。

6. 根据检测结果，选一个或多个 BAC 作进一步分析。