细菌内毒素中什么是定量法

目前,国内外广泛应用且检测技术比较成熟的细菌内毒素定量检查法主要有以下四种。
1. 1　凝胶法　是目前最常用的细菌内毒素检查法。即在10mm×75mm的小试管内,加入待检样品和鲎试剂各0. 1ml混合, 37℃、60 min保温反应后, 180°倒转,根据凝胶形成的情况(凝胶是否坚实)作为判定指标的一种半定量法。此法操作简单,经济而且不需要专用仪器。凝胶法既可限量检测内毒素,也可在0. 03 EU•ml-1以上进行半定量测定。
1. 2　显色基质法(合成基质法、显色合成基质法, Chromoge-nic Technique)　系根据细菌内毒素与LAL(或TAL)试剂中的C系反应所激活的凝固酶,使用人工合成的鲎三肽(即与PNA相连的显色基质如BOC-LEU-GLY-ARG-PNA等)作为显色基质,水解鲎三肽中的精氨酸肽链,通过测量反应液中释放出游离的对硝基苯胺(PNA)的吸光值而进行定量的一种检测方法。该法需要专用仪器。目前主要用于微量血浆、血清、全血、骨髓液及尿、乳汁等的临床检验以及家禽、实验动物、人工脏器的安全性评估等方面。根据测定原理的不同分为终点显色法和动态显色法。
1.2.1　终点显色法(EndopointColorimetric Assay)　系根据在一定时间内游离出的PNA的量与细菌内毒素浓度成正比例关系进行测定的一种分析方法。PNA(黄色)的吸光度值可使用单波长405 nm或双波长(测定波长405 nm、参照波长492 nm)测量,或利用游离的PNA与红色偶氮试剂发生反应所形成的红色偶氮蓝复合物在545nm单波长或双波长(测定波长545 nm、参照波长630 nm)进行检测。一般可在0. 006~15 EU/ml范围内进行定量。
1.2.2　动态显色法(Kinetic Colorimetric Assay)　系根据游离的PNA的吸光度变化率(mAbs/min)与细菌内毒素浓度成正比例关系(比色反应速度法Pate Assay)或到达事先设定的反应吸光度变化值所需要的时间Ta的对数值与细菌内毒素浓度的对数值成反比例关系(比色反应时间法OD-Time As-say)进行测定的一种分析方法。一般可在0. 006~50 EU/ml范围内进行定量。
1. 3　酶联免疫测定法(ELISA法)　基于抗原抗体的酶联免疫测定法,目前在国外应用十分普遍。主要由外加热原质刺激巨嗜细胞后产生的内热原物质(如TNF, TL-1等),而进行的定量测定方法。体外人全血热原检测方法是近年来国内外正在兴起的一种研究热原检测的新方法,具有检测范围广,灵敏度高,不同个体血液的结果差异小等优点[2, 3]。国内一些学者,已采用酶联免疫测定法对体外人全血热原检测方法的可行性进行研究和优化,取得了可喜的进展[4]。1. 4　浊度法(Turbidim etrc Technique)　系微量的内毒素与TAL(LAL)试剂中的C因子发生反应,由内毒素引发激活的凝固酶,切断凝固蛋白特定位置的精氨酸肽键,形成凝固蛋白从而产生凝胶过程中的浊度变化,采用适当的光学仪器测量的一种分析方法。此法操作比较简单、经济、灵敏度高,检测范围广。通常在0. 006~300 EU/ml的范围内进行定量,但需要专用仪器。根据测定原理的不同又可分为终点浊度法和动态浊度法。
1.4.1　终点浊度法(EndopintTurbidimetric Technique)　即根据到达规定点上反应液的最终浊度值(吸光度或透过光亮值)与细菌内毒素浓度成正比例或反比例的关系而进行测量的一种检测方法。由于未形成标准化,目前国内外都很少使用,也未见有专门仪器使用。
1.4.2　动态浊度法(Kinetic Turbidimetric Technique)　即根据测定到达事先设定反应液的浊度变化(吸光度变化)值所需要的时间(Ta比浊反应法)或浊度变化(透过光量比)值所需要的时间(Tg:比浊时间分析法)的对数值与细菌内毒素浓度的对数值成反比例关系或浊度的(吸光度值)每分钟变化(吸光度变化mAbs/min)与细菌内毒素浓度成正比例关系(比浊反应速度法)而进行测量的一种分析方法。通常,浊度法一般是指动态浊度法,而且在日、美、欧等国有专用仪器,并通过美国FDA认可,其中作为动态比浊仪一般要求为:恒温槽(37±1℃)、光源、检测器及内置数据分析等。其中检测波长从80~660 nm,主要根据仪器的不同而各异,检测时间为60~90 min之间。由于国内对细菌内毒素定量检查法的研究起步较晚,专门用于定量的高灵敏度TAL(最低检测限是0. 006EU/ml)还未研制开发出来,还受细菌内毒素检查用水(内毒素的含量小于0. 005 EU/ml)、内毒素标准品质量不高等因素的制约,对仪器定量法研究较多且检测技术较为成熟的就是动态浊度法。本法收载于2000年版《中国药典》二部附录中,在2005年版《中国药典》二部附录中,将浊度法和显色基质法修订为光度测定法,作为测定内毒素含量的方法。