细菌简单染色实验

实验方法原理

常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷）。因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别，常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。

当细菌分解糖类产酸使培养基 pH 下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。

实验材料 枯草芽孢杆菌 （12-18 h 营养琼脂斜面培养物）藤黄微球菌（约 24 h 营养琼脂斜面培养物）

试剂、试剂盒 吕氏碱性美蓝染液／草酸按结晶紫染液齐氏石炭酸复红染液

仪器、耗材 显微镜酒精灯载玻片接种环双层瓶（内装香柏油和二甲苯）擦镜纸生理盐水

实验步骤

1. 涂片

取两块载玻片，各滴一小滴（或用接种环挑取 1~2 环）生理盐水（或蒸馏水）于玻片中央，用接环以无菌操作（图 IV-1）分别从枯草芽泡杆菌和藤黄微球菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀井涂成薄膜。若用菌悬液（或液体培养物）涂片可用接种环挑取 2~3 环直接涂于载玻片上（图 IV-2）。

2. 干燥

室温自然干燥。

3. 固定

涂面朝上，通过火焰 2~3 次。

此操作过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态。并使之牢固附着在载玻片上。

4. 染色

将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄膜为宜）。吕氏碱性美蓝染色 1~2 min，石炭酸复红（或草酸铵结晶紫）染色约 1 min。

5. 水洗

倒去染液。用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。

6. 干燥

自然干燥，或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。

7. 镜检

涂片干后镜检。

注意事项

1. 载玻片要洁净无油斑，滴生理盐水和取菌不宜过多，涂片要涂抹均匀。不宜过厚。

2. 热固定温度不宜过高（以玻片背面不烫手为宜），否剿会改变甚至破坏细胞形态。

3. 水洗时不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下。水流不宜过急、过大，以免涂片薄膜脱落。

4. 涂片必须完全干燥后才能用油镜观察。