细菌的简单染色（Simplestain）和革兰氏染色2

（3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜），使细胞质凝固，以固定细菌的形态，并使其不易脱落。但不能在火焰上烤，否则细菌形态将毁坏
（4）染色：将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加复红染色1-2min
（5）水洗：用水洗去涂片上的染色液，直至冲下之水无色时为止。
（6）干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。
（7）镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。
2、革兰氏染色：
（1）涂片
（2）晾干
（3）固定，与简单染色法相同
（4）结晶紫染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1分钟；水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。
（5）媒染：碘液，媒染1min；水洗：用水洗去碘液。
（6）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20—25s至流出液无色，立即水洗。
（7）复染：滴加复红复染3-5min；水洗：用水洗去涂片上的复红染色液。
（8）晾干：将染好的涂片用吸水纸吸干。
（9）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。
（10)实验完毕后的处理：
①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净，
a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。
b.用擦镜纸沾少许乙醚-乙醇混合液将镜头擦2-3次。
c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2-3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。将显微镜小心轻拿，按号放入显微镜柜中。
②观察后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净，放入回收容器内。
五.注意事项
1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。
2.染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。
3.选用幼龄的细菌。G+菌培养12h-16h，E.coli培养24h。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。