细菌细胞壁的染色法和细胞质膜的观察

一、目的要求
　　1．学习掌握细菌  细胞壁的染色法。
　　2．利用质壁分离法观察细菌的细胞壁和细胞质膜。
　　二、基本原理
　　细菌细胞壁很薄，革兰氏阳性菌的细胞壁为20—30nm，革兰氏阴性菌的细胞壁为10—13nm。组成细菌细胞壁的主要化学成分是肽聚糖，它与染料结合的能力差，不易着色，在细菌的染色过程中，一般情况染料都是通过细胞壁的渗透、扩散等作用而进入细胞，细胞壁本身并未染色，因此，欲通过染色来观察细胞壁，必须设法使细胞壁能着色，而细胞质则不易着色，常用的方法有单宁酸法和磷钼酸法。单宁酸和磷钼酸都是起媒染作用，它们使细胞壁形成可着色的复合物，而使细胞质不易被着色，经结晶紫或甲基绿染色后，便可在普通光学显微镜下观察到细胞壁。
　　根据细菌细胞在高渗溶液中或用乙醚蒸气处理后，会产生质壁分离这一现象，经染色后也可在普通光学显微镜下区分细胞壁和细胞质膜。
　　三、器材
　　巨大芽孢杆菌（Bacillus megatherium），枯草芽孢杆菌；
　　0．2％结晶紫水溶液，5％单宁酸（鞣酸）水溶液，1％磷钼酸水溶液，1％甲基绿水溶液，25％NaCl水溶液，0．01％结晶紫水溶液，Bouin氏固定液，0．1％硫堇（thionine）水溶液，乙醚，乙醚蒸气瓶等。
　　四、操作步骤
　　1．单宁酸法
　　(1)将培养16—18小时的巨大芽孢杆菌按常法制成涂片。
　　(2)用5％单宁酸染5分钟后，水洗。
　　(3)用0．2％结晶紫染3—5分钟，水洗，吹干。用油镜观察，细胞壁呈紫色，细胞质呈淡紫色。
　　2．磷钼酸法
　　(1)制备浓厚的涂片，在未干时浸入1％磷钼酸水溶液3—5分钟。
　　(2)用1％甲基绿水溶液染3—5分钟。
　　(3)水洗后，吹干，用油镜观察。细胞壁为绿色，细胞质无色。
　　3．区分细胞壁与细胞质膜
　　(1)乙醚蒸气法
　　(a)将巨大芽孢杆菌涂布于盖玻片上，翻转盖玻片使其放在乙醚蒸气瓶的瓶口上蒸3分钟。
　　(b)取下盖玻片置Bouin氏固定液中30分钟后取出，水洗。
　　(c)用硫堇染色30秒钟。
　　(d)水洗，水封，置油镜下观察。
　　(2)NaCl法
　　(a)取一滴25％NaCl溶液于洁净的载玻片上。
　　(b)挑一小环培养6小时的枯草芽孢杆菌，在25％NaCl水滴中涂布均匀，待自然干燥。
　　(c)滴加0．01％结晶紫于其上，使盖满有菌部分，30秒钟后水洗，干燥，用油镜观察结果。
　　五、实验报告
　　1．结果
　　绘图示细菌细胞壁与细胞质膜。
　　2．思考题
　　比较单宁酸法与磷钼酸法、乙醚蒸汽法与NaCl法之间的异同，根据你所做的试验认为哪种方法好？