细菌的革兰氏染色和特殊形态观察

实验原理

染色方法：
革兰染色法是细菌学中zui广泛使用的一种鉴别染色法。1884 年 由丹麦医师 Gram 创立。方法是先将细菌用结晶紫染色，加媒染剂（增加染料和 细胞的亲和力）后，用脱色剂（酒精或丙酮）脱色，再用复染剂染色。如果细菌 不被脱色而保存原染液颜色者为革兰阳性菌(G＋)；如被脱色，而染上复染液的颜 色者为革兰阴性菌(G-)。此染色法可将所有具有细胞壁的细菌分为两大类：革兰 阳性菌和革兰阴性菌。

单染色法：只能观察微生物的大小、形状、和细胞排列状况，但不能鉴别微生物以及它的特殊构造等。

复染色法：用两种或两种以上染色液进行染色，有协助鉴别微生物的作用，故也称鉴别染色法。常用的有：革兰氏染色法、抗酸染色法、芽孢染色法、鞭毛染色法等。

染色原理： 现在认为细菌对革兰染色的不同反应主要是革兰阳性菌和阴性菌 的细胞壁结构与化学组成不同。革兰阳性菌的细胞壁较厚，肽聚糖含量多，且交 联度大，脂类含量少，经 95％乙醇脱色时，肽聚糖层的孔径变小，通透性降低， 与细胞结合的结晶紫与碘的复合物不易被脱掉，因此细胞仍保留初染时的颜色。 而革兰阴性菌的细胞壁较薄，含有较多的类脂质，而肽聚糖的含量较少，乙醇脱 色时溶解外层类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易 于渗出，结果细胞被脱色，经复染后，又染上复染的颜色。

实验试剂

革兰氏染色液一套 
结晶紫
碘液
95%乙醇
番红花红
孔雀绿

实验设备

显微镜
盖玻片
载玻片

实验材料

菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌

实验步骤

1. 革兰氏染色 
  （1）涂片

  （2）初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。

  （3）媒染：先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。

  （4）脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约15－20秒，后立即用流水冲洗。

  （5）复染：滴加番红染色液，染3－5分钟，水洗后用吸水纸吸干。 

  （6）镜检：观察染色结果并绘图。

2. 染色过程：涂片（大肠杆菌和金黄色葡萄球菌）→干燥→固定→初染（结晶 染色过程： 紫染色 1min）→媒染（碘 1min）→水洗→95%乙醇脱色（1min）→复染（番红花 红染色 1min）→干燥→镜检（油镜）

3. 油镜的使用与保养
  （1）在需观察部位的玻片上滴加一滴香柏油，然后慢慢转动油镜，在转 换油镜时，从侧面水平注视镜头与玻片的距离，使镜头浸入油中而 又不以压破载玻片为宜。 
  （2）用双眼观察目镜，并慢慢转动粗调节器至出现模糊物象，然后用细 调节器至物象清晰为止。 
  （3）如果不出现物象或者目标不理想要重找。 
  （4）油镜使用完毕，先用擦镜纸沾少许乙醇将镜头上和标本上的香柏油 擦去，然后再用干擦镜纸擦干净。

注意事项

1. 菌种应选用对数期的菌种； 
2. 涂片不易过厚，涂片薄而均匀为好； 
3. 脱色不足或脱色过度均会造成革兰染色的假阳性或假阴性，脱色时间 取决于涂片厚度、室温等；
4. 实验结束请确保油镜头擦拭干净。