胎儿有核红细胞在无创产前诊断中应用

随着经济的高速发展，在生活水平提高的同时，人们的生活压力也日渐增大，加上雾霾等环境污染的加剧和各种慢性疾病发生率的增长，都严重影响了人们的生殖能力，随之而来的不孕不育、胎儿先天缺陷等问题已经成了亟待解决的难题。目前，我国每年新增出生缺陷约90万例，不仅严重影响了儿童的健康，也给整个家庭和社会带来了严重的经济负担。随着人工辅助生殖（试管婴儿）、胚胎植入前遗传学筛查技术（Preimplantation Genetic Screening， PGS）以及产前诊断等生物医学技术的发展和普及，这些问题已经得到了很好的缓解，也为成千上万为此困扰的家庭带来了希望。

无创产前诊断方法（Noninvasiveprenatal test, NIPT）

传统的创伤性产前诊断技术如羊膜穿刺活检、绒毛膜活检、脐带穿刺术和脐血取样法均具有对孕妇造成流产的风险，并可能引起早产、感染、母体免疫反应等并发症。相比较羊膜穿刺等传统诊断方法，无创产前诊断具有以下技术优势：误诊率低、流产风险低、可诊断染色体疾病及多种遗传性疾病。在高通量基因组测序的时代背景下，无创产前检测能以非侵入母体的方式提前预知胎儿健康状况，可判断胎儿是否具有特定疾病的遗传风险，在医学领域的发展前景广阔。

无创产前诊断方法

目前已知妊娠妇女外周血中主要存在两种来源的胎儿细胞，一种是胎盘细胞，如合体滋养细胞和细胞滋养细胞；另一种是胎儿血细胞，如淋巴细胞、粒细胞及胎儿有核红细胞（FNRBCs）等。FNRBCs从妊娠早期（6 周）至分娩持续存在于母体外周血中，12-14周时数量最多，而正常未孕妇女外周血中几乎无FNRBCs。FNRBCs生命周期较短，约为90d ，不会受既往妊娠的影响。FNRBCs 属单核细胞，易从形态学上辨别，而且其含有胎儿基因的全部遗传信息。此外,FNRBCs表达数种特异性抗原，如转铁蛋白受体CD71，CD36，血型糖蛋白A （GlycophorinA，GPA，CD235a），胎儿血红蛋白（HbF，γ、ε、ζ肽链）等，都能作为识别胎儿细胞的标记。基于以上特征，FNRBCs成为用于无创产前诊断的理想研究对象。胎儿有核红细胞（fetalnucleated red blood cells, FNRBCs）

分离纯化FNRBCs的方法

孕妇外周血中血有核红细胞（NRBC）含量极少，大约为2～6个/mL孕妇外周血，所以需要进行富集分离才能进行进一步的基因分析或者诊断。目前较常用的分离纯化胎儿有核红细胞的方法包括：流式细胞分选（FACS），磁珠分选（MACS），密度梯度离心法，电流分离法(CFS)，显微操作分离单个细胞法，微流控芯片，亲和素分离法等。

流式检测分选FNRBCs实验流程

1.收集5-10 mL妊娠妇女外周血

2.使用Vacutainer CPT管分离PBMC

3.CD71，CD36，CD235a等FNRBCs表面特异标志物染色

4.Fixation/PermeabilizationSolution进行固定破膜（可选）

5.HbF，PI（或其他核酸染料）等FNRBCs胞内特异标志物染色（可选）

6.流式分析及分选，细胞镜检，分子生物学检测

FNRBCs在产前诊断中的应用

利用FNRBCs可以进行胎儿性别检测和Rh血型诊断，以及很多胎儿相关疾病的诊断，如非整倍体检测（21三体、13三体、18三体综合症），地中海贫血，杜氏型肌营养不良（DMD）以及巨细胞感染等。同时可以对病理性妊娠提前筛查，如胎儿生长受限、胎儿窘迫、子痫前期等，为优生优育和妊娠期健康提供保障。

早期应用较广的基因检测分析方法主要是以特异性染色体DNA探针进行荧光原位杂交（FISH）和PCR。目前基于单细胞测序技术的快速发展，可在分离单细胞的基础上通过MDA或MALBAC技术针对单个细胞的基因组进行扩增，进而利用NGS技术对FNRBCs细胞进行遗传分析，未来可以期待在胎儿出生前提供全面的遗传学咨询。