脂肪酸β氧化

实验原理:
在肝脏中，脂肪酸经β-氧化作用生成乙酰辅酶A。2分子乙酰辅酶A可缩合生成乙酰乙酸。乙酰乙酸可脱羧生成丙酮，也可还原生成β-羟丁酸。乙酰乙酸、β-羟丁酸和丙酮总称为酮体。
本实验用新鲜肝糜与丁酸保温，生成的丙酮在碱性条件下，与碘生成碘仿。反应式如下：
2NaOH +I2─→NaOI +NaI +H2O
CH3COCH3 +3NaOI ─→CHI3（碘仿）+CH3COONa +2NaOH
剩余的碘，可以用标准硫代硫酸钠滴定。
NaOI +NaI +2HCl ─→I2 +2NaCl +2H2O
I2 +2Na2S2O3─→Na2S4O6 +2NaI
根据滴定样品与滴定对照所消耗的硫代硫酸钠溶液体积之差，可以计算由丁酸氧化生成丙酮的量。
试剂和器材
一、试剂
0.1%淀粉溶液；0.9%氯化钠溶液； 15%三氯乙酸溶液；10%氢氧化钠溶液；10％盐酸溶。
0.5mol/L丁酸溶液：取5 mL丁酸溶于100 mL0.5mol/L氢氧化钠溶液中。
0.1mol/L碘溶液：称取12.7g碘和约25g碘化钾溶于水中，稀释到1000 mL，混匀，用标准0.05mol/L硫代硫酸钠溶液标定。
标准0.01mol/L硫代硫酸钠溶液：临用时将已标定的0.05mol/L硫代硫酸钠溶液稀释成0.01mol /L。

1/15mol/L pH7.6磷酸盐缓冲液：1/15mol/L磷酸氢二钠溶液86.8mL与1/15mol/L磷酸二氢钠溶液13.2mL混合。
二、材料
新鲜猪肝。
三、器材
锥形瓶50mL（′ 2）;移液管5mL（′ 5），2mL（′ 45）；微量滴定管5mL（′ 1）;漏斗；恒温水浴。
操作方法
一、肝糜的制备
称取肝组织5g置于研钵中。加少量0.9%氯化钠溶液，研磨成细浆。再加入0.9%氯化钠溶液至总体积为 10mL。
二、β-氧化作用
取2个50mL锥形瓶，各加入3mL 1/15mol/L pH7.6磷酸盐缓冲液。向其中一个锥形瓶中加入2mL正丁酸，另一个锥形瓶作为对照，不加正丁酸。然后各加入2mL肝组织糜。混匀，置于37℃恒温水浴中保温。
二、沉淀蛋白质
保温1.5小时后，取出锥形瓶，各加入3mL15%三氯乙酸溶液，在对照瓶内追加2mL正丁酸，混匀，静置15分钟后过滤。将滤液分别收集在两个试管中。
三、酮体的测定
吸取2种滤液各2mL分别放入另两个锥形瓶中，再各加3mL0.1mol/L碘溶液和3mL10%氢氧化钠溶液。摇匀后，静置10分钟。加入3mL10%盐酸溶液中和。然后用0.01mol/L标准硫代硫酸钠溶液滴定剩余的碘。滴定至浅黄色时，加入3滴淀粉溶液作为指示剂。摇匀，并继续滴到蓝色消失。记录滴定样品与对照所用的硫代硫酸钠溶液的毫升数，并按下式计算样品中的丙酮含量。
四、计算
肝脏中的丙酮含量（mmol/g）=（A-B）×C Na2S2O3×1/6
式中：A为滴定对照所消耗的0.01mol/L硫代硫酸钠溶液的mL数；
B为滴定样品所消耗的0.01mol/L硫代硫酸钠溶液的mL数。
C Na2S2O3为标准硫代硫酸钠溶液的浓度(mol/L)。
注意事项
肝糜必须新鲜，放置过久则失去氧化脂肪酸的能力。