苯酚法提取酵母RNA实验原理和操作步骤

（一）原理
细胞内大部分RNA 均与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。因此，提取RNA时要把RNA与蛋白质分离并除去。将细胞置于含有十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate,SDS）的缓冲液中，加等体积水饱和酚，通过剧裂振荡，然后离心形成上层水相和下层酚相。核酸溶于水相，被苯酚变性的蛋白质或者溶于酚相，或者在两相界面处形成凝胶层。
本实验采用的0.15mol/L 缓冲液系统可使大部分RNA-蛋白复合物解离，而DNA-蛋白复合物只有极少部分解离；用酚处理时DNA-蛋白复合物变性，在低温条件下从水相中除去，这样得到的RNA 制品中混杂的DNA 极少。用氯仿-异戊醇继续处理RNA 制品，可进一步除去其中少量的蛋白质。最后用乙醇使RNA 从水溶液中沉淀出来。本法得到的RNA 不仅纯度高，而且多呈自然状态，可供继续研究之用。
（二）主要仪器和试剂
1．仪器
（1）台式高速离心机（10 000r/min）
（2）水浴
（3）Eppendorf 管（1.5mL）
（4）紫外可见分光光度计
（5）冰箱或冷柜（0～4℃）
（6）振荡器
（7）分析天平（精确至0.1mg）
（8）真空干燥器
 2．试剂（均为分析纯）
（1）SDS- 缓冲液：0.3％ SDS，0.1mol/L NaCl，0.05mol/L 乙酸钠，用乙酸调到pH5.0。
（2）饱和酚液：重蒸苯酚用（1）溶液饱和。
（3）氯仿-异戊醇液：24﹕1（V/V）。
（4）含2％乙酸钾的95％乙醇溶液。
（5）无水乙醇
（6）乙醚
（7）溶菌酶（B.R.）（1mg/mL）
（三）操作步骤
1．取1g 活性干酵母在研钵中研碎，加10mL SDS-缓冲液使成匀浆，洗入各Eppendorf管（略少于管容积的一半），加溶菌酶0.1mL，混匀，室温静置10min，再加等体积饱和酚液，室温下剧烈振荡5min。
2.置冰浴中分层，在0～4℃低温环境下，10 000r/min 离心10min。吸出上层清液，转入新的Eppendorf 管，加等体积氯仿-异戊醇，室温下剧烈振荡2.5min，然后10 000r/min 离心5min。

3.吸出上层清液，转入另一新Eppendorf 管，加2 倍体积95％乙醇（含2％乙酸钾），在冰浴中放置30min，使RNA 沉淀。
4.再以10 000r/min 离心5min，弃上清液，沉淀用少许无水乙醇和乙醚各洗一次，即加乙醇或乙醚，迅速离心各1min，保留沉淀。
5.倾去乙醚后，减压真空干燥，准确称重，记录。
6.RNA 制品纯度的测定及RNA 提取率的计算与浓盐法相同。