药物诱导细胞凋亡时Bcl2蛋白含量的变化

【原理】

Western印迹法，把聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的组分从凝胶转移至一种固定支持体，以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。对于蛋白质来说，通常使用的探针是抗体，它与附着于支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。

【试剂与器材】

1.细胞裂解液：50mmol/LTris-HCl,150mmol/LNacl,5mmol/LEDTA,1%NP40，0.05%PMSF，2μg/mLAprotinin,0.5μg/mLLeupeptin，pH8.0

2.2×上样buffer：100mmol/LTris-HCl,pH6.8，200mmol/LDTT,4%SDS，0.2%溴酚蓝，20%甘油

3.分离胶：水，30%丙烯酰胺溶液，1.5mol/LTris(pH8.8)，10%SDS，10%过硫酸铵，TEMED

4.浓缩胶：水，30%丙烯酰胺溶液，1.0mol/LTris(pH8.8)，10%SDS，10%过硫酸铵，TEMED

5.1×电泳buffer：25mmol/LTris-Hcl,pH8.0,250mmol/L甘氨酸,0.1%SDS,pH8.3

6.电转移buffer：39mmol/L甘氨酸,48mmol/LTris-Hcl,0.037%SDS,20%甲醇

7.封闭液：5%脱脂奶粉，0.02%叠氮钠，0.02%Tween-20溶于PBS

8.漂洗液Ⅰ(0.01mol/LPBS，pH7.2)

9.漂洗液Ⅱ(150mmol/LNaCl,50mmol/LTris-Cl,pH7.5)

10.二抗稀释液(5%脱脂奶粉，0.02%Tween-20，150mmol/LNaCl,50mmol/LTris-Cl,pH7.5)

11.ECL显色液：试剂盒

12.微型垂直板电泳槽

【操作步骤】

(1)样品制备

将细胞以4.0×108/L密度接种于用12孔培养板中，每孔3mL，37℃、5%CO2孵箱中培养至细胞贴壁，加入长春新碱，使之终浓度分别为0、10、100μg/mL。继续培养过夜。弃去培养基，以冷PBS(pH7.2)洗涤细胞，每孔加入100μL细胞裂解液,用细胞刮刮下细胞，-20℃放置20min,将裂解液收集于1.5mL的EP管中，冰上超声破碎细胞（10s/次×3次，间隔15s），4℃，12000×g离心5min，收集上清液，蛋白质样品与等体积2×上样buffer混匀，煮沸5min，紫外分光光度法测定蛋白质浓度（A215/A225）。立即上样或将样品保存于-20℃备用。

(2)SDS-PAGE

采用微型垂直板电泳槽制备0.75mm厚的凝胶。首先制备10mL12.5%分离胶，混匀后立即灌胶，小心加蒸馏水覆盖，室温聚合30min，胶聚合后，倾去蒸馏水。制备5mL5%成层胶，插入样品梳，避免产生气泡，室温聚合40min，小心取出样品梳，用蒸馏水小心冲洗加样孔数遍后，将凝胶板装到电泳槽上，加入1×电泳buffer。上样50μg/孔。恒压200V电泳约45min，当溴酚蓝到达分离胶底部时，关闭电源，小心剥离凝胶。

(3)用考马斯亮蓝R-250对凝胶染色及脱色

(4)转膜

按照凝胶>NC膜>滤纸的顺序，剪好一张NC膜（标记一角）和6张新华滤纸，将NC膜在蒸馏水中浸泡5min以消除气泡，同时用电转移buffer浸泡滤纸、凝胶、吸水海棉层。按说明书装好电转移槽，将黑色多孔塑料夹放在最底层，再依次放置吸水海棉层、3层滤纸、凝胶、NC膜、3层滤纸、海棉层、无色多孔塑料夹，注意赶气泡，合拢好夹子放入电转移槽中(黑的靠黑的，白的靠红的)，正确连接电极，即胶朝阴极，NC膜靠阳极，使凝胶上的蛋白质向NC膜印迹转移。100V恒压，加冰条件下电转移3h。起始电流应小于250mA，结束电流不应超过400mA。

(5)免疫印迹

从电泳槽上取出NC膜，用PBS洗2次，以除去NC膜上的凝胶。装NC膜于一可加热封接的塑料袋中，加入封闭液(5%脱脂奶粉，0.02%叠氮钠，0.02%Tween-20溶于PBS)，放在平缓摇动的摇床封闭3h。封闭结束，将膜转移至新的可加热封接的塑料袋中，按0.1mL/cm2的量加入封闭液和适量的第一抗体（兔抗大鼠Bcl-2单克隆抗体1∶200），封口，4℃振摇过夜。剪开塑料袋，用约200mL漂洗液Ⅰ洗3次，各10min，以除去过量的一抗。用漂洗液Ⅱ洗3次，每次10min，除去NC膜上的磷酸盐及叠氮钠。将膜转入另一塑料袋，加入溶于二抗稀释液的二抗(1∶5000)，封口，室温平缓摇动1h。取出NC膜，用大量漂洗液Ⅱ洗5次，各10min，以除去未结合的二抗。将ECL显色液Ａ与Ｂ临用前等量混合，浸泡膜1min，暗室X-ray胶片曝光，显影、定影，翻拍成照片，永久保存或成像系统成像保存。