蛋白与蛋白相互作用分析—免疫共沉淀

 实验原理

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是以抗体和抗原之间的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G"特异性地结合抗体Fc段的现象而开发出来的方法，是研究蛋白质相互作用的经典方法，主要用于确定两种蛋白质在完整细胞内是否存在生理性相互作用。其原理是：当细胞在非变性条件下裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用可以被保留下来。如果用蛋白质X的抗体进行免疫沉淀，那么在细胞内与X结合的蛋白质Y也能被沉淀下来。目前多将精制的protein A/G预先结合固化在agarose beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的protein A就能吸附抗原及其结合蛋白，通过低速离心，可以将目的抗原及其结合蛋白与其它成分分离。

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实验步骤

1.转染24-48 h后，刮取细胞，转移到15mL离心管，1000rpm离心5min，用冰预冷的PBS洗涤细胞一次，细胞沉淀用1mL冰预冷的PBS重悬，移至Eppendorf管，4°C 12000rpm离心1min，弃上清；

2.加入适量NP-40细胞裂解缓冲液（用前新鲜加入蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min, 每隔10min Vortex一次 (每次大约30sec)，4℃ 12000rpm离心1 min，上清移至新的Eppendorf管；

3.蛋白定量，每组取适量（通常100μg-1mg）蛋白，用细胞裂解液调整体积使每组一致（通常总体积500-1000μL），加入40 μL (50% 悬浮液) Protein A/G琼脂糖珠；

4.4°C孵育30min – 2h，以去除蛋白与Protein A/G琼脂糖珠的非特异结合（pre-clear）；

5.4°C，2500rpm 离心3 min，上清移至新的Eppendorf管；

6.加入第一抗体，4°C旋转孵育过夜；

7.次日，每管加入40 μL (50% 悬浮液) Protein A/G琼脂糖珠，4°C缓慢旋转孵育1–3h；

8.4°C，2500rpm 离心3 min，小心吸去上清，琼脂糖珠用1mL裂解缓冲液洗3－4次；每次可样品置于4°C缓慢旋转孵育10min；

9.最后一次吸干所有液体，加入40μl的1×SDS 上样缓冲液，Vortex，然后用离心机轻甩30sec；

10.沸水煮5分钟，12,000rpm离心1min；

11.SDS-PAGE并进行Western blot检测。

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注意事项

1．本实验需要在4°C进行。

2．细胞裂解采用温和的裂解缓冲液，不能破坏细胞内存在的蛋白质-蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。

3．为防止蛋白的降解，细胞裂解缓冲液必须新鲜加入蛋白酶抑制剂，如Roche的cocktail inhibitor。

4．要注意抗体的选择，并不是所有抗体都适合做IP，需要仔细检查抗体的说明书，说明书上标注适用于IP的才行。

5．要使用对照抗体，以确保共沉淀的蛋白是由所加入的特异性抗体沉淀得到的，而不是与抗体的非特异结合。

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个人心得

1.通常孵育时溶液的总体积小于离心管容积的1/2，这样有利于溶液的充分混合以保证抗原抗体的充分结合。

2.蛋白裂解液与抗体孵育后，加入Protein A/G琼脂糖珠前，可对Protein A/G琼脂糖珠用蛋白裂解液洗涤一次，可将几组需要的琼脂糖珠一并进行洗涤，然后用蛋白裂解液重悬后再平均分到各组，这样可以避免每管所加琼脂糖珠在体积上的差异。

3.检测过表达蛋白的相互作用，用标签抗体进行免疫沉淀比较容易，细胞裂解液需要的量较少（100-200μg）；而检测内源性蛋白的相互作用，细胞裂解液需要的量较多（1-5mg），并且对抗体的要求更高，务必确定该抗体适用于做免疫沉淀，选择好用的抗体，最好参考文献。

4.检测过表达蛋白的相互作用，转染24h后就可有高水平的表达，但通常我们选择转染后36h收细胞进行实验。

5.先将细胞裂解液与抗体孵育，再与Protein A/G琼脂糖珠孵育是一种方法，也可将抗体先与Protein A/G琼脂糖珠孵育，再与pre-clear过的蛋白裂解液孵育也是可行的。二者在结果上没有明显差别。

6.洗涤可以将样品置于4°C缓慢旋转孵育5-10min，也可手工颠倒混匀，然后放于冰上，重复几次，感觉前者比较方便。

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NP-40裂解液配方（100ml）

NaCl:               0.8766g

NP-40:              0.5ml

Tris-Hcl:            Tris-Hcl:0.6057g;  Hcl:210ul

去离子水补齐至100ml