蛋白翻译后修饰的基金申请解析与研究注意点（一）

每年三月初，都是科研界的“高考”倒计时，因为距离国自然基金申请的截止日期已不到半月。纵观历年国自然申请情况，蛋白的翻译后修饰都是申请中重大研究方向之一。2018年国自然统计表明，磷酸化、泛素化、乙酰化等修饰的相关基金项目，总研究资助金额超过2亿。

继上周的肠道微生物研究方案解析后（国自然冲刺：打通菌群多样性与功能的研究策略），本周我们再抓紧时间为各位老师分享一下国自然中各类修饰的趋势分析及组学研究的注意事项，以期为各位老师提供帮助。下面我们主要关注三种最常规研究的修饰类型——磷酸化修饰、泛素化修饰和乙酰化修饰。

表现稳定：磷酸化——全能调控之王

磷酸化是修饰中的全能调控之王，其研究最早，且分布广，修饰量最多。在真核细胞中，约1/3的蛋白随时都可以被磷酸化，几乎参与所有的生理、病理过程。因此，磷酸化修饰是所有修饰中最被广泛认知和重点研究的。

▲ 磷酸化修饰在历年国自然基金中的申请情况

综上这些特点，在国自然基金申请中，与磷酸化、激酶相关的研究历年所获的资助项目数目均较多、且金额较高。然而，其成熟的研究基础也使得其每年的基金资助趋势稳定平缓。2018年的基金统计结果表明，与磷酸化相关的项目数有105个，资助金额4768万，而与激酶相关的项目数140个，资助金额高达6414.9万，其中重点项目有2个。因此，磷酸化可以说是修饰的基金申请中一个表现非常稳定的方向。

图1.国自然基金项目统计-磷酸化

▲ 磷酸化修饰组学研究方案的技术注意点：

● 磷酸化修饰肽段富集方法如何选择？

由于发生磷酸化修饰的氨基酸有三种--丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸，故根据研究目的的不同，磷酸化修饰肽段的富集方法也不同。目前，比较成熟的磷酸化富集方法主要有：金属螯合物富集（如TiO2、IMAC富集）和抗体富集两类。

对于三种氨基酸位点上的修饰均关注的老师来说，金属螯合物富集是最常用的富集介质。其富集效率较高，通常可以达到90%以上，其中一些商品化的IMAC试剂盒具备很理想的富集稳定性。

而对于重点关注酪氨酸磷酸化修饰变化的老师来说（比如说不少关注肿瘤领域中受体酪氨酸激酶研究的方向），使用TiO2、IMAC则无法满足要求了，这是由于酪氨酸磷酸化的修饰比例非常低，仅占所有蛋白质磷酸化比例的1%。因此，针对这类分析，往往采用酪氨酸特异性基序的抗体进行富集，才能获得最佳结果（中科新生命（APT）采用抗体界的金标准--CST的抗体进行酪氨酸磷酸化的富集）。

● 对于后续结果验证或者靶向检测的研究目的，如果没有修饰位点的抗体该怎么办？

基于质谱的PRM技术是修饰组后续验证或目标位点靶向检测的最佳选择之一。PRM验证全称是Parallel Reaction Monitoring,其是基于高分辨率质谱发展的靶向定量技术。由于其只针对特定目标信号进行扫描，可实现目标蛋白、修饰位点的精准定量，其应用目的类似于Western blot。 

PRM已逐渐被业内广泛认可和关注，Nature、PNAS等高水平研究中已有多篇研究应用。此外，PRM可同时对多个蛋白、修饰位点进行定量，相比传统的WB,不仅更准确、精细而且更高效。目前，中科新生命已推出磷酸化修饰组+PRM验证一站式服务，帮助老师快速解决验证之忧。

● 磷酸化修饰组对样本量的要求如何？

势头正猛：泛素化——蛋白表达调控研究的新角度

泛素化是所有修饰中最为特别的一类修饰，由于发生泛素化修饰的蛋白往往会进一步通过蛋白酶体发生降解（也有一部分会发挥脚手架的作用促进蛋白复合体形成等），因此，蛋白表达水平变化往往是泛素化修饰的重要关注点。泛素化修饰与转录、蛋白水平研究同样重要的，都是调控蛋白表达水平的重要机制之一，但却往往被研究人员所忽略，其具备相对较高的研究创新性。

▲ 泛素化修饰在历年国自然基金中的申请情况

从历年的基金申请情况看，泛素化修饰所申请项目数与金额自2013年后每年均呈现快速增长趋势，而且2017年-2018年的增长速度为历年最快。统计结果表明，2018年泛素化研究的资助项目达137个，资助金额共6680.45万，其中重点项目有5个。