蛋白质定量实验

蛋白质分子中的芳香族氨基酸酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基，其化学结构中的共轭双键，具有吸收紫外光的特性，吸收高峰在280 nm处，蛋白质溶液的吸光度(A280)与蛋白质含量成正比关系，可作为样品中蛋白质定量测定。该方法简便、灵敏、快速，且样品用量少且可回收，低浓度的盐类也不干扰测定，但测定的准确度比Lowry法低，这是由于对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基含量差异较大的蛋白质时有一定的差距。若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，会出现较大的误差。

蛋白样品

考马斯亮蓝 G250 乙醇 磷酸

紫外分光光度计

(1) 准备 100~1500 ug/ml 的标准品, 溶于 Bradford 法相兼容缓冲液中。对于较稀的样品，可能通过增加样品在试剂体积中的比率而扩大灵敏度（microBradfordassay:1~25ug/mL)。如果样品与染料的比值太高, 可能会增加反应混合物的 PH 而导致反应背景较高。

(2) 将标准品和待测样品加人到一次性的比色皿中 (应该使用一次性的塑料比色皿或微孔板，因为染料会黏附到各种材料容器的表面上）。

(3)Bradford 试剂预热至室温。将 ImL 染料溶液加人到 25 uL 蛋白质样品中，混勻，室温孵育 10 min。

(4) 检测 450rnn 和 595nm 处的吸光度 (可以使用 570~610nm 的基于滤光器的仪器，对检测性能不会有明显的降低）。

(5) 对 595 nm 处的数据作图，或为提高在低反应值处的精度，对 595 nm/450 nm 的比率作图。标准反应曲线可以拟合为一个多项式反应，由此可以估算出待测样品的浓度值.

1. 测定液必须澄清，否则造成测定结果误差。

2. 由于蛋白质的紫外吸收高峰常因pH的改变而变化，故应用紫外吸收法时要注意溶液的pH，最好与制定标准曲线时的pH一致。