血浆中C5a的ELISA测定

实验概要

C5活化是过敏毒素释放和膜攻击杀伤细胞机制的开始。C5活化后产生C5a和C5b两个片段，C5a被血清羧肽酶N裂解成无活性的C5a-desarg。C5a对中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞及巨噬细胞有趋化作用，并参与初次免疫应答，控制抗体合成和感染的发生及发展。因此检测C5裂解产物对临床监视病情发展有一定的意义。本实验用ELISA对血浆中C5a进行了测定。

实验原理

将抗C5a单克隆抗体包被固相聚苯乙烯板，加入经聚乙二醇(PEG)处理的待测样本，然后依次加入兔抗人C5a-IgC多克隆抗体和过氧化物酶标记的猪抗兔IsC，再加入底物2，2’-连氮-双(3-乙基苯骈唑啉-6-磺酸盐)(ABTS)和H₂O₂显色，于酶标仪405mn处测定每分钟光密度增加量(OD/min)，以OD/min为纵坐标，C5a标准晶浓度为横坐标绘制标准曲线图，求出待测样本中C5a的含量。

主要试剂

1. PBSPH7.2，9mmol/L磷酸盐缓冲液含140mmol/L NaCl。

2. PBS-Tween pH7.2 PBS含0.05％Tween20，简称PBS-T。

3. 底物溶液：100mL 2mmol/L ABTS溶液中含100mmol/L醋酸钠，50mmol/L磷酸钠，2.5mmol/L H₂O₂。

4. 沉淀剂：①：100mL pH8.0，20mmoL/L Tris-甘氨酸-HCl缓冲液中含20g PEG 4 000，0.8g Rivanol；沉淀剂②：100mLpH2.0.100mmol／L甘氨酸-HCl缓冲液中含20g PEG4000。

实验步骤

1. 用盐和/或PEG沉淀血浆中C5：在微量反应板中加入EDTA抗凝血浆100gL，然后加人100/uL沉淀剂，用下述三种方法中任何一种沉淀血浆中C5。

   1) 在微量反应板中加入100uL 2mol/L HCl与100uL EDTA抗凝血浆混合，室温5h。加入HCl后血浆pH值在1.0-1.5之间。上清用4倍体积的0.29mol/L Tris调节至pH7.1-7.4。

   2) 在微量反应板中加入100uL沉淀剂①，室温30min。

   3) 在微量反应板中加入100uL沉淀剂②(血浆pH值在4.0-4.5之间)。室温30min。用方法2)和方法3)沉淀C5后，上清加入4倍体积的含0.05％Tween 20 pH7，10.21mol/L Tris-HCl缓冲液，血浆被稀释10倍。

2.   用抗C5a单克隆抗体(McAb)包被酶标反应板：用pHl0.6，50mmol/L碳酸钠溶液将抗C5aMcAb稀释成10ug/mL，每孔加100uL，4℃  16h。次日取出每孔加含1％(W/V)明胶的PBSl50gL，室温lmin；然后用PBS-Tween 20洗涤一次。

3. 样本中CSa的检测：

洗涤后的酶标板，每孔加入方法1)、2)或3)处理的血浆样本zoot&，4℃16h，用PBS-Tween20洗涤1次，每孔加入用含0．1％明胶的PBS-T稀释的兔抗人CSa-IgC．多克隆抗体(46ug/mL)100t&，室温2h，用PBS-Tween20洗涤3次；每孔加入用含0.1％明胶PBS-T稀释的过氧化物酶标记的猪抗兔IgClOOt&(稀释前lmL过氧化物酶偶联物内加100ul无关鼠McAb、10ul人血浆或10ul激活的人血清处理)，室温2min，每孔用PBS-Tween20洗涤4次；每孔加入底物溶液100ul，lmin后以PBS-T调零，每3min于酶标仪405nm处读取OD值。以OD/min增加量计算过氧化物酶活性。其活性与血浆中C5a含量呈正相关。本法最低检测极限为1ng/mL，此法未检测出正常人新鲜血浆中的C5a。

4.  标准曲线的绘制：取已知浓度纯化的C5a，对倍稀释成一系列不同的浓度(0.039-5.000ng/mL)，分别加入包被有抗C5aMcAb的酶标板中，然后按上述方法依次加入兔抗人C5a-IgC和过氧化物酶偶联的猪抗兔IgC及过氧化物酶的底物，以PBS-Tween调零点，读取OD40s/min增加量，以C5a(desarg)浓度为横坐标，OD40s/minx  200为纵坐标绘制标准曲线。每次绘制标准曲线应取6个已知浓度的纯化C5a。