血细胞分离培养方法和步骤1

以前认为红细胞、粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等血细胞都属终末分化细胞，很难在体外培养生长或仅能短期培养而不能传代，近年来由于细胞培养技术的发展，已有血细胞培养成功的报道，正常血细胞在体外培养生长时间短，只有白血病细胞，血友病细胞、淋巴瘤细胞可培养成功并建立细胞系，但多半为EB病毒等致瘤病毒引起的转化细胞，（EBNA检查阳性），二甲基亚砜（DMSO）处理也可诱导这些细胞分化发生逆转，表现为正常细胞。所建立的细胞系多半为单核细胞系、B淋巴细胞系、T淋巴细胞系，只在IL-2产品问世后，T细胞才可在体外建系、建株。
血细胞可从外周血中用梯度液通过离心分层后分离获得。也可从脾脏、扁桃体、淋巴结中用机械法切碎过筛分离获得淋巴细胞，从腹腔刺激后的冲洗液中可获得大量的单核-巨噬细胞，从骨髓中可以获得前提血细胞，并可长期培养生长。加入生长因子或某些物质有利于细胞纯化并促进分化和生长繁殖，例如在淋巴细胞中加入IL-2（TCGF），可促进T细胞生长，建立T淋巴细胞系。在多发性骨髓瘤细胞（B细胞）培养中，加B细胞生长因子，可建立B细胞系；加入IL-6（或正常淋巴细胞培养48h的培养上清中的IL6）可使B细胞在体外长期培养，建立了IL-6依赖的B9细胞系。在骨髓单个核细胞培养中加入二羟基维生素D3,可使单个核细胞分化为成骨细胞及破骨细胞。

（一）外周血细胞分离：
外周血中除红细胞外，还有粒细胞、单核细胞和淋巴细胞及血小板等，通常是分离这些血细胞的重要来源。其分离方法有四种：自然沉降法、差异沉降法、氯化铵分离法、Ficoll分离法。
1、自然沉降法：
将无菌抗凝血放入试管中，在37℃水浴中静置，自然沉降1-2h，可见到红细胞下沉，并有明显分层，上层血浆中富含有大量的 和淋巴细胞，下层主要为红细胞。此方法简便但各层中的细胞种类多，不纯。血浆中虽以粒细胞、淋巴细胞为主，但也含有血小板，大单核细胞和少量红细胞。下层虽以红细胞为主，但也有上述各种细胞，此法适用于淋巴细胞转化试验。
2、差异沉降法：
用6%的右旋糖酐或3%的明胶溶液无菌消毒后，分装于中试管中，由于这些物质能使红细胞形成“串状”，比粒细胞、淋巴细胞沉降速度快，因而可使红细胞与白细胞、淋巴细胞分离开。其方法如下：用6%的右旋糖酐溶液5-10ml，经抗凝血5ml加入上层中混合后静置于37℃水浴中30-60min，即可见红细胞下沉，上层富含大量粒细胞和淋巴细胞，下层为红细胞，使两者易于分离开，取上层可用于粒细胞、淋巴细胞培养和实验，下层可用于红细胞培养和实验，经PBS洗3次后即可加入培养基培养，可用于天然白细胞干扰素的诱生和生产。此法分离的细胞纯度也不高。
3、氯化铵分离法：
0.83%氯化铵（NH4CL）可使红细胞破裂，通常将分离获得的粒细胞。淋巴细胞中混有的少量的红细胞用0.83%氯化铵进行裂解，以排除红细胞的干扰。另外，此法也适合大量粒细胞、淋巴细胞的分离制备，在天然白细胞干扰素诱生和生产中已被广泛应用。方法如下：
将中心血站供应的健康人外周血离心分离白细胞黄层悬液先经2000r/min离心20min，吸出上清血浆，将下层的红细胞、白细胞混合后，加入0.83氯化铵，用量为血细胞悬液液量的3倍，于4℃作用20min后离心弃去上清。
在沉淀层中再加入新鲜0.83氯化铵混匀后于4℃作用20min，以便彻底清除红细胞，离心弃上清。
收货下层的细胞用PBS洗3次后，再用含5%人AB型血清的（含100U/ml卡拉霉素）培养基制成悬液，调整细胞浓度为（8-10）x10^9个/L，分瓶加塞在37℃普通培养箱中旋转培养（12r/h）。
混悬细胞时若加入干扰素诱导剂（NDV-F）诱导22h，收货上清就可生产白细胞干扰素。此法分离的细胞纯度更差。
4、Ficoll分离法：
采用Ficoll和泛影葡胺配制而成的淋巴细胞分离液，通过2000r/min离心后可使血细胞以不同相对密度分离开，如分离淋巴细胞可选用相对密度1.077的分离液；若分离血小板可用相对密度1.090的分离液，若分离骨髓中的单核细胞常用相对密度1.120的分离液，现以淋巴细胞分离为例，方法如下。
取中心血站供应的抗凝血细胞或初步分离的白细胞黄层细胞悬液，用无钙、镁离子的PBS稀释3-4倍。
将Ficoll淋巴细胞分离液事先分装于离心管中，使其沉于管底，并在37℃中预热。
用吸管将经稀释的血细胞悬液沿离心管壁缓慢加入，不让细胞悬液冲破分层液界面，使其悬于分层液上方。
以2000r/min离心20min后，不同细胞可依相对密度不同而分布于各位置上，由于红细胞在Ficoll作用下成串下沉，故在离心管中分布在Ficoll层下方，淋巴细胞分布在Ficoll层上方。