超高分辨直接观测基因表达的染色质时空调控

　　生命科学的一个基本问题是在个体发育中，单个细胞如何分化成各种类型的组织细胞。这个过程高度依赖于基因表达的精确时空调控，而这种细胞特异基因表达与染色质的调控密切相关。比如，不同的顺式调控原件增强子能够在不同细胞中选择性地激活目标基因。每个基因经常由分布在千碱基(kb)甚至兆碱基(Mb)以外的多个增强子来调节，而增强子能够选择性地激活靶基因常常归因于基因组的三维空间结构。因此，在纳米尺度、千碱基分辨率条件下研究染色质的三维结构对解析胚胎发育过程中细胞分化与细胞命运决定至关重要。

　　基于高通量测序的染色质构象捕获技术（3C和Hi-C）已经鉴定出大量的组织特异染色质环（loops），并发现了胚胎发育不同时期的特异染色质拓扑结构域（TADs）。但是这些研究主要是群体细胞分析的结果，并不能知道单细胞行为是否有所不同。单细胞Hi-C方法虽然揭示了染色质结构的异质性，但其分辨率不足以在单细胞水平看到清晰的TAD结构。2018年11月份，哈佛大学庄小威实验室和其博后Alistair Boettiger（现任职于斯坦福大学的助理教授）在Science上发表论文，利用她们早期建立的MERFISH技术，结合超高分辨显微成像技术解析了30 kb分辨率下的单细胞TAD结构【1】。利用这个方法直接证明了类TAD结构域是在细胞里真实存在的物理性结构，同时也发现类TAD结构以及其边界（boundaries）在单细胞中的高度异质性。但是30 kb的分辨率并不足以看到基因内部的精细结构，比如组织特异的增强子与启动子相互作用等。（专家解读丨庄小威组在Science总结超分辨显微成像技术）

　　2019年3月19日，Alistair Boettiger实验室又在Nature以长文发表题为Visualizing DNA folding and RNAin embryos at single-cell resolution的论文，把染色质DNA检测的分辨率提高到2 kb，能清晰得看到增强子与启动子相互作用，并且同时检测新生RNA（nascent RNA）水平来研究增强子与启动子相互作用对基因转录的影响【2】。利用该方法，这项工作做到了在胚胎中上千个细胞中同时原位检测染色质三维结构和基因表达。这项令人激动的成果展示了如何高精度直接观测基因表达的染色质时空调控。

　　首先Alistair Boettiger实验室开发并命名一项名为ORCA（Optical Reconstructionof Chromatin Architecture)的新技术, 暂且翻译为染色质结构的光学重建技术（图1）。其原理和去年庄小威实验室与Alistair Boettiger实验室一起发表在Science论文中的技术并无差异，主要是把MERFISH与STORM技术有机结合（详见：专家解读Science | 庄小威实验室揭示单细胞染色质超分辨显微结构）。但ORCA技术通过优化条件提高了基因组分辨率到2 kb、同时检测了mRNA和新生RNA、并且应用于果蝇胚胎。

图1. ORCA染色质结构的光学重建技术

　　本文的研究主要集中在bithorax complex(BX-C)区域（图2）, BX-C属于Hox基因家族成员，该区域由Ubx、Abd-A、Abd-B三个基因组成,跨越330kb。这三个基因通过各自的增强子精细调控它们组织特异的表达，每个基因的表达异常都会导致发育缺陷甚至致死。所以进一步研究这个区域的染色质三维结构、组织特异的增强子与启动子相互作用至关重要。

图2. bithorax complex(BX-C)区域

　　研究者首先通过结合smFISH标记RNA和OCRA标记基因组DNA，在同一个果蝇胚胎中检测了18种mRNA（图3a），11种新生RNA（图3b）以及OCRA方法检测了330 kb BX-C区域基因组DNA（图3c）；这些方法可以使我们清楚地观察到各个基因在果蝇胚胎中组织的特异表达以及在各个组织中对应的染色体三维结构。

图3. 果蝇胚胎中检测mNRA、新生RNA和OCRA包含BX-C的330 kb基因组DNA

　　为了进一步研究BC-X在组织特异表达的调控机制，研究者首先把果蝇胚胎分成了Head,T1-T3,A1-A9等13段（segments）（图4a），图中可以清楚的看到Head与T3的BX-C的染色质三维结构是完全不同的（图4b）。

图4. 果蝇胚胎分段以及对应的BX-C染色质三维结构

　　以前的实验表明，组蛋白H3K27me3的表观修饰对BX-C中的三个基因Ubx、Abd-A、Abd-B的表达起到决定性作用。H3K27me3修饰的区域独立形成一个结构域（TAD），并与没有H3K27me3的修饰区域形成明显的边界（Boundaries）,其中具有H3K27me3修饰的结构域里面的基因将被沉默（图5，左列）。OCRA技术也可以很好地检测到类似的结构域边界（Boundaries），而且还可以检测到额外的结构域边界。这些新边界的位置与激活的增强子重叠（图5，右列）。

图5. OCRA揭示胚胎组织特异的结构域

　　为了证实染色质结构域（TADs）及其边界（Boundaries）在调节胚胎发育过程中对组织特异基因表达的重要性，研究者选择了Fub缺失突变株(△Fub)做进一步研究。△Fub缺失了4 kb，正好包含了A1段（segment）的边界(图5e)。△Fub果蝇的表型也是A1段形态异常，鉴定发现是由于A1段Abd-A表达异常所致。作者用OCRA证实了A1段的边界消失（图6a），BX-C区域染色质三维结构异常（图6b）以及Abd-A表达异常（图6c）。

图6. OCRA揭示TAD边界的突变对染色质结构域以及基因表达的影响

　　OCRA染色质结构的光学重建技术可以在纳米尺度，千碱基分辨率下解析胚胎组织特异的染色质结构域内部的精细调控。利用这一个方法详细解析了果蝇基因组中BX-C区域是如何通过染色质结构的变化来选择性的激活或沉默基因表达，使得胚胎正常发育。OCRA技术的另一个优势是可以在同一单细胞中同时检测染色质三维结构与RNA水平，为研究基因在细胞分化、胚胎发育和疾病发生过程中的作用机制打开一扇新的大门。

　　以高通量测序为基础Hi-C能够构建染色质相互作用图谱（contact map），但其缺点是非直接观测，另外在同一个单细胞里构建染色质三维结构与检测RNA水平也还相当挑战。而以高通量成像为基础OCRA技术可以通过直接观测构建染色质空间图谱（spatial map），并且可以同时提供染色质调控和基因表达水平，但目前的一个缺点是通量目前还比较低，要像Hi-C一样把它应用于全基因组中还比较困难；基因组的覆盖范围有望未来随着实验成本的降低进一步提高。总体来说，这两类技术在研究基因组三维结构中将会是很好的互补。同时这两类技术还可以和活细胞跟踪等技术相结合，在空间和时间维度上进一步阐述基因组结构域的形成、保持和动态变化，以及与基因表达的关系。

　　注：据悉，该篇解读文章是马涵慧和颉伟二位老师从中国前往加拿大开会（会议主题与本文直接相关）的旅途中完成，特别感谢！马涵慧博士为上海科技大学生命科学与技术学院的助理教授、研究员，近几年来一直从事表观遗传学与三维基因组的工作，连续开发了CRISPRainbow、CRISPR-Sirius等基因组活细胞成像技术跟踪染色质在细胞不同时期的动态变化，以通讯作者身份在Nature Biotechnology、NatureMethods、PNAS等杂志上发表相关论文（Nature Methods丨马涵慧组等开发出高灵敏CRISPR-Sirius染色体活细胞成像方法）。

　　参考文献

　　1. BintuB, Mateo LJ, Su JH, Sinnott-Armstrong NA, Parker M, Kinrot S, Yamaya S,Boettiger NA & Zhuang X. (2018) Super-resolution chromatin tracing revealsdomains and cooperative interactions in single cells. Science 362,419.

　　2. Mateo1LJ, Murphy SE, Hafner A, Cinquini IS, Walker CA & Boettiger AN.(2019) VisualizingDNA folding and RNA in embryos at single-cell resolution. Nature.