转化毕赤酵母

实验概要

本实验介绍了毕赤酵母的转化方法。

主要试剂

1. 转化当天，配制下列试剂：存于4度

5% SDS溶液

RD(Regeneration Dextrose) 融化琼脂100ml

2. 溶液：转化试剂

40%PEG：用水配制40%(w/v)PEG3350(试剂纯)

CaT：20mMTris pH7.5，20mM CaCl₂

SOS：1M山梨醇，0.3×YPD，10mM CaCl₂

3. 每次转化时配制：

SED：19mlSE 加1ml 1M DTT

PEG/CaT：1:1混合40%PEG及CaT

实验材料

GS115中，用SalI，StuI或SacI线性化的DNA可分离His Mut 重组子

KM71中，用SalI，StuI或SacI线性化的DNA可分离His Muts重组子

亲代载体用相同酶线性化

对照包括无DNA，线性化PBR322DNA及质粒(无细胞)涂板来检测是否有污染

实验步骤

1. 程序：

   1) 将RDB平板放于室温，准备好融化的RD上层琼脂，取出线性化DNA置于冰上。

   2) 取100ul去壁细胞到1.5 ml灭菌的有盖管中。

   3) 取10ugDNA，室温孵育10min。

   4) 同时配制PEG/CaT溶液，计算所需用量，加入等量的40%PEG/CaT(1:1)。

   5) 加1ml新鲜的PEG/CaT溶液至细胞与DNA混合物中，轻轻混匀，室温孵育10min。

   6) 室温750g离心10min，小心抽吸PEG/CaT溶液，颠倒管，轻叩管壁以排出多余的PEG/CaT溶液。

   7) 用150ulSOS培养基悬浮转化细胞，室温孵育20min。

   8) 加入850ul1M山梨醇，接下来涂板。

2. 涂板：毕赤酵母去壁细胞需要铺在顶层琼脂糖或琼脂上，以防止在选择前被裂解

   1) 接第8步，取100-300ul去壁细胞-DNA，与10ml融化的RD琼脂糖混匀倒于RDB平板上，直至上层琼脂变硬。注意，确保有足够的去壁细胞-DNA铺第二板，第三板。

   2) 倒置平板，28-30度孵育，转化子会在4-6天内出现。

   3) 细胞活性：用100ul去壁细胞加入900ul 1M山梨醇。

   4) 取稀释样本100ul，加入10ml融化的RDH，铺在RDHB平板上，等上层琼脂凝固。

   5) 倒置平板，28-30度孵育，4-6天出现克隆，表明去壁细胞可再生成分裂细胞。