转基因植物的分子检测与鉴定方法（三）

3  转基因植株外源基因表达情况的检测与鉴定

尽管在mRNA水平也能一定程度地研究外源基因的表达，但存在mRNA在细胞质中被特异性地降解等情况，mRNA与表达蛋白质的相关性不高(相关系数低于0.5)，基因表达的中间产物mRNA水平的研究并不能取代基因最终表达产物的研究。转基因植株外源基因表达的产物一般为蛋白，外源基因编码蛋白在转基因植物中能够正常表达并表现出应有的功能才是植物基因转化的最终目的。外源基因表达蛋白检测主要利用免疫学原理，ELISA及Western杂交是外源基因表达蛋白检测的经典方法。

3.1  ELISA检测

ELISA是酶联免疫吸附法(enzyme—linked immunosorbent assays)的简称，基础是抗原或抗体的同相化及抗原或抗体的酶标记，把抗原抗体反应的高度专一性、敏感性与酶的高效催化特性有机结合，从而达到定性或定量测定的目的。ELISA有直接法、间接法和双抗夹心法之分，目前使用最多的是双抗夹心法，其灵敏度最高。一般ELISA为定性检测，但若作出已知转基因成分浓度与吸光度值的标准曲线，也可据此来确定样品转基因成分的含量，达到半定量测定。该方法已在棉花、辣椒、水稻、烟草、番茄等多种转化植株的检测中应用。

使用ELISA检测外源基因表达蛋白具有便捷、灵敏、特异性好、试剂商业化程度高、成本低、适用范围广、试验结果易读等特点。但也存在易出现本底过高，缺乏标准化等问题。

3.2  western杂交

Western杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的蛋白质检测技术，其原理是将聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)分离的目的蛋白原位固定在固相膜上(如硝酸纤维膜)，再将膜放入高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭非特异性位点，然后在印迹上用特定抗体(一抗)与目的蛋白(抗原)杂交，再加入能与一抗专一结合的标记二抗，最后通过二抗上的标记化合物的性质进行检出。根据检出结果，可知目的蛋白是否表达，浓度大小及大致的分子量。此方法特异性高，可用于定性检测。

由于Western杂交是在翻译水平上检测目的基因的表达结果，能够直接表现出目的基因的导入对植株的影响，一定程度上反映了转基因的成败，所以具有非常重要的意义，被广泛采用。该方法已应用于烟草、青蒿、枸杞、杨树等相关目的基因导入后的表达。Western杂交的缺点是操作烦琐，费用较高，不适合做批量检测。

4转基因植株检测的其它技术

4.1  基因芯片技术

生物芯片技术是起源于核酸分子杂交，于20世纪80年代提出，90年代初期迅速发展，生物芯片(biochip)是指高密度固定在固相支持介质上的生物信息分子(如寡核苷酸、基因片段、cDNA片段或多肽、蛋白质)的微阵列。生物芯片可分为基因芯片及蛋白质芯片。这两类芯片都可用于转基因植物的检测与鉴定，但目前应用潜力较大的是用于转基因植株中外源基因表达调控的cDNA芯片。cDNA芯片能够检测出由外源基因整合及外源基因不同的整合方式所引起的植物基因组任何微小的表达差异。将不同被测样品的mRNA分别用不同的荧光物质标记，各种探针等量混合与同一阵列杂交，可以得到外源基因表达强度差异的信息，从而实现外源基因表达调控的比对研究。将目前通用的报告基因、选择标记基因、目的基因、启动子和终止子的特异片段固定于玻片上制成检测芯片，与从待检植株抽提、扩增、标记后DNA杂交，杂交信号经扫描仪扫描后，再经计算机软件进行分析判断，可对转化植株进行有效筛选。

与常规技术相比，生物芯片技术的突出特点是高度并行性、多样性、微型化及自动化。

目前，由于受到成本高的局限，使得该项技术的推广应用受到了限制，同时，一些假阳性背景也使得其应用受限。相信随着生命技术的不断向前发展，计算机处理软件的进一步开发利用，生物芯片必将得到越来越多的应用。