通过欺骗免疫系统来改善血友病基因疗法的递送

　　在一些血友病基因疗法中，腺相关病毒(AAV)作为载体来递送表达功能凝血因子的基因。这种方法的一个局限性是，大多数人已经对AAV产生了自然免疫，这可能使治疗无效。近日，由意大利米兰San Raffaele Telethon基因治疗研究所的科学家们领导的一个小组发现了一种可能的方法：通过欺骗免疫系统来改善血友病基因疗法的递送。

　　他们利用天然抑制剂CD47整合到慢病毒载体(LVs)的表面，抵消吞噬细胞对它们的捕获，结果发现：肝细胞基因转移效率更高，急性炎症反应的激活减少；在非人灵长类动物(NHPs)的实验中，LVs能够在不引起毒性的情况下将治疗基因转移到肝细胞——体内凝血因子合成的主要场所。这项研究于5月22日发表在Science Translational Medicine杂志上。

　　递送血友病基因疗法，慢病毒载体具有潜力

　　针对遗传性凝血障碍血友病的肝靶向基因治疗是基因治疗最成功的应用之一。目前，重组凝血因子VIII或IX(FIX)蛋白替代治疗(PRT)分别是A型血友病和B型血友病的标准治疗。然而，基因治疗可能会在一次给药后建立一个稳定的组织功能因子来源，从而避免终生频繁静脉注射PRT的要求，并有可能提供对该病的彻底治愈。

　　单次静脉注射重组腺相关病毒(AAV)衍生载体，将凝血因子基因的功能副本运送至肝脏(凝血因子基因的天然生产部位)，已显示出对血友病患者的安全性和有效性，并有望成为临床可用的治疗选择。

　　然而，由于AAV载体不能主动整合到宿主细胞基因组中，并且抗AAV免疫反应限制了载体的重新整合，这类基因治疗可能难以应用于儿童患者。此外，相当一部分成年患者对AAV预先免疫；因此，他们由于具有中和的抗AAV抗体(Abs)而没有资格接受AAV载体给药，或者由于对AAV衣壳的细胞免疫，需要免疫抑制一段时间来维持AAV转导的肝细胞。

　　在I/II期研究中，基因疗法先驱Spark Therapeutics的SPK-8011用于治疗A型血友病，使得12名患者的年出血率和输血需求均下降了97%。然而，值得注意的是，Spark试验中剂量最高的2名患者(即进入III期试验的剂量)出现了免疫反应，导致他们的因子水平降至正常水平的5%以下。

　　和AAV一样，慢病毒(LV)也被用于基因治疗。Bluebird Bio的LentiGlobin，旨在治疗另外的血液疾病  -β地中海贫血症和严重的镰状细胞病，使用LV将人类β-珠蛋白基因的功能性版本插入患者的造血干细胞中。

　　LV由HIV衍生而来，它不像AAV那么流行，因此应该是更好的基因治疗递送载体选择。研究者认为，随着时间的推移，AAV疗法的疗效似乎在减弱，而这正是LV可能拥有的另一种优势。因为LVs能积极地整合到宿主细胞基因组中，并在细胞分裂时得以维持，如果不与插入突变的显着风险相关，这对于建立长期表达具有潜在优势。

　　CD47  -别吃我信号

　　然而，意大利的研究人员注意到，在发挥治疗作用之前，LV可以被肝和脾的吞噬细胞(吞噬外来分子的白细胞)清除。

　　众所周知，CD47蛋白是一种抑制巨噬细胞吞噬的信号分子，信号调节蛋白α(SIRP-α)的特异性配体。

　　因此，圣拉斐尔Telethon基因治疗研究所的科学主任Luigi Naldini和同事们假设，将CD47连接到LV可以帮助基因疗法逃离巨噬细胞的“魔爪”。

　　整合CD47到慢病毒，逃避免疫从而提高效率

　　研究通过瞬时转染过表达CD47，构建了先前报道中的LV稳定生产细胞系和293T细胞，用于LV生产。为此，研究人员用CD47表达的自失活γ逆转录病毒载体(SIN RVs)转导这些细胞。

　　在293T细胞和LV生产细胞系(CD47hi细胞)的细胞表面上实现了CD47蛋白稳定10至30倍的过表达。由CD47hi细胞产生的LV在对照293T细胞上具有与亲本细胞产生的载体相当的滴度和感染性，并且通过电子显微镜显示CD47的免疫染色显着增加(P<0.0001)。

　　LV表面上CD47的量不影响包膜蛋白 -水泡性口炎病毒蛋白G(VSV.G)的存在，与CD47hi LV的未改变的感染性一致。当CD47hi和对照LV与巨噬细胞系或原代人巨噬细胞一起孵育时，发现CD47hi LV的摄取显着降低(P=0.0303)，其达到对照293T细胞中观察到的基础水平。相反，人巨噬细胞对无CD47LV的摄取显着高于对照LV(P=0.0083)。

　　这些数据表明，调节LV颗粒上CD47的量可以影响人巨噬细胞对它们的摄取。

　　在NOD小鼠的体内研究中，CD47hi LV表现出对吞噬作用和先天免疫激活的易感性降低；活体成像显示，CD47调节KCs(库弗氏细胞)对LV吞噬作用的速率和程度。

　　NHPs是最接近人类的模型，和人类之间SIRP-α和CD47的序列同源性分别为94%和99%。因此，下一步研究选择恒河猴作为受试者，因为与其他NHP物种相比，对HIV感染的限制较低。

　　他们证明，LVs向NHP的体内施用(静脉注射)是安全且耐受良好的，并且表明CD47hi LV对先天免疫系统的活化减少，并且进一步增加肝细胞基因转移。

　　尽管全基因组LV整合必然意味着对延迟的肿瘤发生的担忧，但该研究结果显示在NHP中没有LV转导的肝细胞或肝肿瘤扩张的迹象，尽管存在治疗个体数量和观察时间的固有限制。NHP肝脏和脾脏中的LV IS分析显示出不同的组成，几乎所有独特的IS由1-4个基因组代表，表明没有发生克隆扩增，并且与处理的NHP中大多数肝细胞预期的低至无增殖率一致。

　　此外，迄今为止，在几项临床试验中，LV转导的造血干细胞(HSCs)或T细胞治疗的数百名患者中，没有任何关于插入性肿瘤发生的证据，这包括对最早接受治疗的患者随访10年以上。鉴于HSC对致癌转化的敏感性可能高于肝细胞，这些发现令人放心，并支持LV设计、IS选择和多克隆重建都有助于减轻这种风险的说法。

　　研究小组补充说，整合CD47可以降低所需的LV剂量，从而缓解制造需求，并降低副作用的可能性。