酵母蛋白质和RNA的制备（稀碱法）

实验概要

本实验介绍了从酵母中分离制备蛋白质和 RNA 的原理和方法。

实验原理

酵母细胞富含蛋白质和核酸。用稀碱液（0.2% 的氢氧化钠）处理酵母使细胞裂解，离心收集上清液，得到酵母核蛋白抽提液。用盐酸调节抽提液 pH 至 3.0 （核蛋白的等电点），核蛋白溶解度下降大量沉出，离心收集沉淀物为酵母蛋白质粗制品。

酵母核蛋白是一种结合蛋白质，是蛋白质与核酸的复合物。酵母核酸主要是 RNA （含量为干菌体的 2.67 ％-10.0 ％）， DNA 含量较少，仅为 0.03％ -0.516％。如设法使酵母核蛋自中的蛋白质与核酸分离并除去蛋白质和 DNA ，就可得到较纯的 RNA 制品。这可通过以下操作完成：将核蛋自制品溶于含有 SDS 的缓冲液中，加等体积的水饱和酚，剧烈振荡后离心，溶液分成两层，上层为水相含有 RNA，下层为酚相，变性蛋白及 DNA 存在于酚相及两相界面处。吸出水相并加乙醇即可沉淀出酵母 RNA。若用氯仿-异戊醇进一步处理 RNA 制品，可获得纯度更高的 RNA。

主要试剂

1. 0.2％ NaOH 溶液

2. 6 mol/LHCl 溶液

3. 95％乙醇

4. SDS-缓冲液：0.3% SDS，0.1 mol/L NaCl，0.05 mol/l 乙酸钠，用乙酸调到 pH5.0

5. 饱和酚液：重蒸苯酚用4溶液饱和

6. 氯仿一异戊醇液：24 ：1(V/V)

7. 含2%乙酸钾的95％乙醇溶液

8. 无水乙醇

9. 乙醚

主要设备

1. 离心机

2. 干燥箱

3. 恒温水浴

4. 真空千燥器

5. 天平

6. 751 型分光光度计

7. 冰箱

8. 量筒（50ml）

9. 蒸发皿

10. Eppendorf 管（1.5 ml）

11. 烧杯（50m1，100ml）

实验材料

鲜酵母或干酵母粉，pH0.5一5.0的精密试纸。

实验步骤

1. 酵母核蛋白的提取

称取鲜酵母 30g 或干酵母粉 5g, 倒入 100ml 的烧杯中。加入 40ml 0.2%NaOH 溶液，在 20-40℃水浴上搅拌提取 30-60min 后 4000r/min 下离心 10min, 取上清液于 50ml 的烧杯中，并置于放有冰块的 250ml 烧杯中冷却，待冷至 10℃以下时，用 6mol/L HCl 小心地调节溶液的 pH 至 3.0 左右。随着 pH 下降，溶液中白色沉淀逐渐增加，到等电点时沉淀最多（注意严格控制 pH ）。 pH 调好后继续于冰水中静置 l0min ，使沉淀充分，颗粒变大。将此悬浮液以 3000r/min 离心 20min ，倒掉上层清液。将沉淀物转入蒸发皿内，放入真空干燥器或干燥箱中干燥之后称重，这就是酵母核蛋白粗品。

2. 苯酚法提取酵母 RNA

取上述核蛋白研碎，加 10ml SDS-缓冲液使成匀浆，洗入各 Rppendorf 管（略少于管容积的一半），室温静置 10min ，再加等体积的饱和酚液，室温下剧烈振荡 5min 后置冰浴中分层， 4000r/min 离心 10min ，吸出上层清液，转入新的 Eppendorf 管，加 2 倍体积 95％乙醇（含2％乙酸钾），在冰浴中放置 30min ，使 RNA 沉淀。再以 10 000r/min 离心 5min ，弃上清液，沉淀用少许无水乙醇和乙醚各洗一次，迅速离心各 lmin ，保留沉淀。倾去乙醚后，减压真空干燥，准确称重，记录。
3. 结果处理

   1) 计算核蛋白提取率

   2) RNA 含量测定

将干燥后的 RNA 产品配制成浓度为 10~50 μg/ml 的溶液，在 751 型分光光度计上测定 260nm 处的吸光度，按下式计算 RNA 含量：

式中， A260 为 260nm 处的吸光度； L为比色杯光径（cm）； 0.024 为 1ml 溶液含 1ugRNA 的吸光度。

   3) 计算 RNA 提取率

注意事项

1 .利用等电点控制核蛋白析出时，应严格控制 pH 。

2 .用苯酚法制备 RNA 过程中，用乙醇沉淀得到的 RNA 中，除 RNA 外还含有部分多糖，本实验用用 2% 乙酸钾去溶解非解离的多糖以达到纯化 RNA 的目的。

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