重组毕赤酵母的表达

实验概要

本文介绍了重组毕赤酵母目的基因表达的方法及条件，为毕赤酵母表达因素给予指导，但对于任何表达系统，最优化条件因表达蛋白的特征而不同。

实验步骤

1. Mut 胞内或分泌表达：为检测表达条件是否有效，可培养GS115β-gal (Mut )(胞内表达-半乳糖苷酶)。亲代载体转化GS115 或KM71 作为胞内表达背景对照。

   1) 挑取单克隆，接种至25mlMGY，BMG或BMGY中，(250ml摇瓶)，28-30度，250-300rpm摇至OD600=2-6(对数生长，大约16-18小时)。

   2) 室温1500-3000g离心5min，收集细胞，去除上清，用MM，BMM或BMMY重悬细胞至OD600=1.0，进行诱导表达(大约100-200ml)。

   3) 在1L摇瓶中加入上述培养物，加盖两层灭菌纱布或干酪包布，放入摇床继续生长。

   4) 每24小时，加甲醇至终浓度为0.5%以继续诱导。检查培养基的量，确保正确加入甲醇，因为蒸发作用会减少培养基的体积。

   5) 在下列的各个时间点，取1ml培养基至1-5ml离心管。这些样品用于分析表达水平及确定诱导后收集细胞的最佳时间。室温用水平离心机最大转速离心2-3min。时间点：0，6，12，24(1天)，36，48(2 天)，60，72(3天)，84，96(4天)。

   6) 分泌表达时，将上清转移至单独管中，将上清及细胞沉淀存于-80度直至开始检测。在液N2或干冰/酒精浴中快速冷冻胞内表达时，去除上清将细胞沉淀存于-80度，直至开始检测。在液N2或干冰/酒精浴中快速冷冻。

   7) 用考马斯亮蓝染色SDS-PAGE，western blot 或功能分析方法来分析上清及细胞沉淀的蛋白表达。

2. Muts胞内或分泌表达：可培养GS115 Ablumin (Muts，分泌白蛋白至培养基中)检测培养条件的效率。记住要用转化亲本载体的GS115 或KM71 作为胞内表达的背景对照。

   1) 挑取单克隆，接种至含100mlMGY，BMG 或BMGY的1L隔板摇瓶中。在摇床中28-30度，250-300rpm生长至OD600=2-6(约16-18小时)。

   2) 室温1500-3000g离心5min收集细胞，去除上清，用1/5-1/10原培养基体积的MM，BMM或BMMY 重悬细胞(约10-20ml)。

   3) 置于100ml隔板摇瓶中，用2层灭菌纱布或干酪包布盖住瓶口，放入摇床继续培养。

   4) 每隔24小时，加入甲醇至终浓度为0.5%以继续诱导。

   5) 在下列的各个时间点，取1ml培养基至1-5ml离心管。这些样品用于分析表达水平及确定诱导后收集细胞的最佳时间。室温用水平离心机最大转速离心2-3min。时间点：0，6，12，24(1天)，36，48(2 天)，60，72(3天)，84，96(4天)。

   6) 分泌表达时，将上清转移至单独管中，将上清及细胞沉淀存于-80度直至开始检测。在液N2或干冰/酒精浴中快速冷冻胞内表达时，去除上清将细胞沉淀存于-80度，直至开始检测。在液N2或干冰/酒精浴中快速冷冻。

   7) 用考马斯亮蓝染色SDS-PAGE，western blot 或功能分析方法来分析上清及细胞沉淀的蛋白表达。

3. SDS-PAGE分析：

任何标准SDS-PAGE 仪器及程序均可用，如12%聚丙烯酰胺凝胶，5%浓缩胶用于分离40-100kDa蛋白。样品准备：需要准备Breaking 缓冲液(P60)及酸洗0.5mm玻璃珠。

细胞洗涤准备：(胞内或分泌表达)

   1) 快速融化细胞沉淀，置于冰上。

   2) 每1ml样品，加入100ul裂解缓冲液(细胞 上清)。

   3) 加入等量的酸洗玻璃珠(0.5mm)，通过置换来估算相等体积。

   4) 涡旋30s，冰上孵育30s，重复8次。

   5) 4度最大转速离心10min，将上清转移至干净的微量离心管中。

   6) 取50ul上清(细胞裂解物)，加入50ul 2×SDS-PAGE凝胶上样缓冲液(样品buffer)。

   7) 煮沸10min，每孔加10-20ul，依胶的厚薄及孔量，决定点样量。剩下样品存于-20 度，用于western blot。细胞裂解物存于-80度用于分析。