随机引物法

大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ Klenow 片段模板 DNA

醋酸氨牛血清白蛋白乙醇溴化乙啶NA 终止 贮存缓冲液随机引物缓冲液

碱性琼脂糖凝胶或变性聚丙烯酰胺凝胶沸水浴Sephadex G-50 离心柱

一、材料

1. 缓冲液和溶液

醋酸氨（10 mol/L)

牛血清白蛋白（10 mg/ml)

乙醇

溴化乙啶（10 mg/ml）或 SYBR Gold 染液

NA 终止/贮存缓冲液（50 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5)，50 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA (pH8.0)，0.5% (m/V) SDS）

5X 随机引物缓冲液（250 mmol/L Tris (pH 8.0)，25 mmol/L MgCl₂，20 mmol/L DTT，未标记的 dNTP 各 2 mmol/L，1 mol/L HEPES ( 用 4 mol/L NaOH 调至pH 6.6），1 mg/ml 长度为 6 个碱基的随机脱氧寡核苷酸引物）

2. 酶和缓冲液

大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ Klenow 片段

3. 凝胶

碱性琼脂糖凝胶或变性聚丙烯酰胺凝胶

4. 核酸和寡核苷酸

长度为 6 或 7 个碱基的随机脱氧核苷酸引物（125 ng/μl TE，pH 7.6 )

模板 DNA

5. 放射性复合物

[α-³²P] dNTP ( 10 mCi/ml，比活性 >3000 Ci/mmol）

6. 专用设备

沸水浴

Sephadex G-50 离心柱，用 TE ( pH 7.6) 平衡

二、方法

1. 电泳后用溴化乙锭（终浓度 0.5 μg/ml）或 SYBR Gold 染胶，切下所需条带，尽可能切去多余的凝胶。

2. 将切下的条带放入预先称过重量的微量离心管中，称出带的重量。每克琼脂糖凝胶加水 3 ml。

3. 将微量离心管放在沸水浴中煮 7 min 以使凝胶融化，同时也使 DNA 变性。

如立即进行标记，可将离心管置于 37℃，直至需要加入模板；否则可贮存于 -20℃。但每次从 -20℃ 取出后，含 DNA 的凝胶团要在 100℃ 加热 3~5 min，然后置于 37℃ 直至放射性标记反应开始。

4. 将一个新的微量离心管置于 37℃ 水浴或加热板上，按下列次序加入：

5X 寡核苷酸标记缓冲液            10 μl

10 mg/ml 牛血清白蛋白溶液      2 μl

DNA ( 体积不超过 32 μl）         20~50 ng

10 mCi/ml [α-³²P] dNTP           5 μl

( 比活性 >3000 Ci/mmol）

Klenow 片段（5 单位）            1 μl

水                                           加至 50 μl

用微量加样器彻底混合各组分，于室温温育 2~3 h 或 37℃ 温育 60 min。

5. 在反应液中加入 10 μl NA 终止/贮存缓冲液，可根据需要进行以下步骤。

贮存放射性标记的探针于 -20℃ 以备杂交用。

或

通过离心柱层析分离放射性标记的探针与未结合的 dNTP 或以乙酸铵和乙醇选择性地沉淀放射性标记的 DNA。如果 >50% 的放射 性 dNTP 已在反应中掺入，可不进行该步骤。