鼻内应用免疫调节分子：肺癌局部免疫疗法的探讨

实验概要

肺癌是最常发生的癌症类型之一。在动物模型的初步调查，成功的肺癌患者的治疗需要有前途的治疗试剂。本试验描述了一种方法来诱发小鼠肺肿瘤和免疫分子，直接鼻内应用治疗肺。在这里，我们描述的L1C2和B16F10分别为诱导小鼠细胞系产生肺腺癌或转移性黑色素瘤。在这个模型中的肿瘤细胞小鼠尾静脉注射。监测治疗结果肿瘤的大小，可以用HE染色切片分析。

主要试剂

PBS(Gibco-Invitrogen；cat. no. 14190)

accutase(PAA；cat no. L11-007)

DMEM培养液(Gibco-Invitrogen；cat.no.41965-039)用于B16 - F10细胞的培养

RPMI 1640(Gibco-Invitrogen；cat.no. A10491-01)用于 L1C2细胞的培养

胎牛血清(PAA；cat.no.A11-151)

青霉素/链霉素(PAA；cat. no. P11-01)

台盼蓝((Biochrom AG；cat.no. L6323)

sterofundin(B Braun)

小鼠B16F10黑色素瘤细胞株(ATCC；cat. no. CRL-6475)/ L1C2腺癌细胞株((kindly provided by Prof Wiewrodt)氯化钠(Berlin-Chemie)

主要设备

异氟醚麻醉设备(Eickemeyer Medizintechnik)使用异氟醚麻醉时

一次性移液器

Eppendorf管

红外灯

实验步骤

实验设计

为了诱导L1C2腺癌，我们推荐使用Balbc / J小鼠，诱导B16 - F10黑色素瘤使用C57BL / 6小鼠。建议每只鼠尾静脉注射2×10⁵肿瘤细胞。实验过程需要约21天。如果使用的是其他小鼠品系而非野生型小鼠，注射细胞的数量和持续时间需要先进行测试。鼻内抗体能应用于注射肿瘤细胞后不同的时间点以及不同剂量。抗体的数量取决于你预计在肺中中和对蛋白质的量。分析肿瘤的生长，作石蜡切片，HE染色，按照标过程进行。然后分析肿瘤区域。为此，切片可以在计算机显示器上显示，从而确定肺肿瘤部分面积所占百分比例。为了对肿瘤进行分类，必须在光学显微镜(例如：Zeiss Axio Observer.D1；Axio Vision 4.7 software使用不同的放大倍数分析。

诱导肿瘤：

试剂配置：

准备DMEM培养液 10％的FCS，1％青霉素/链霉素，B16F10细胞和RPMI 10％FCS的 1％青霉素/链霉素，L1C2细胞在4°C保存。

试剂的准备：

1．准备上述所需细胞培养试剂，在37°C预热。时间5分钟。

解冻肿瘤细胞：

2. 将细胞从液氮中拿出，并进行溶解解冻。

3. 完全解冻后，细胞离心800rpm 7分钟，4°C。

4．弃上清用10ml液体悬浮细胞。

5．在50毫升培养瓶中培养细胞1-2天，直到细胞达到70-80％融合。

分裂细胞：

6．倒掉培养液用10mlPBS洗细胞。

7．加入胰酶37°C孵育1 - 2分钟。

25厘米2瓶加入胰酶0.5毫升，75厘米2培养瓶加入胰酶1毫升，175厘米2培养瓶加入胰酶2毫升

8．捶打培养瓶让细胞脱落。

9．加入10毫升培养液终止反应，将细胞悬液转移到试管中。

10．4°C离心7分钟，弃上清液。

11. 重悬细胞，用75厘米2或175厘米2细胞瓶扩大培育。

收集细胞和注射：

12. 重复步骤6-10

13．用10ml液体重悬细胞。

14．加入10μL台盼蓝至细胞悬液中。

15．细胞计数，加入10μL混合液至计数板中计数。数4个小格中细胞数(Q1-Q4)

16．细胞计数公式：(Q1 Q2 Q3 Q4)/4×2 (台盼蓝稀释度) x10⁴

17．取小鼠细胞体积(浓度2×10⁵)然后4°C离心7分钟。

18． 用sterofundin悬浮B16 -F10细胞或RPMI悬浮L1C2细胞使其浓度为1× 10⁶细胞/ ml(200μL/ 2×10⁵细胞注入老鼠)。

19. 准备烧瓶，加入温水。

20．将老鼠固定在注射板上，将尾巴放入三角瓶30秒，或者尾巴也可以使用红外线灯加热。

21．注射器取200μL细胞悬液。

22．注射器水平插入尾部静脉，缓慢注入细胞悬液。

鼻内应用：

试剂设置：

准备滴鼻治疗的试剂，并储存在冰上。为此目的，根据试剂盒稀释抗体或治疗分子浓度(缓冲液中含牛血清白蛋白)。稀释的抗体或其他的治疗分子，几个星期，可以储存在-20°C。注意：鼻内应用量应该是25 - 40μl。

准备麻醉剂：

将1g2，2，2-三溴乙醇溶于1ml，T -戊醇.

加入39毫升PBS漩涡，直到全溶解。

将溶剂4°C避光保存。。

氯胺酮(12mg/ml)/ xylazin(0.088ml/ml)溶解于PBS，4°C保存。

氯胺酮可以储存在4°C的几个星期。

注意：所有的实验中，应根据国家和机构的关于动物护理和使用的指导方针进行。

23. 根据要求准备抗体，储存在冰上。

24. 麻醉小鼠。(这一步可以使用选项A，B或C )

   A. 老鼠腹腔注入200μ三溴乙醇。

   B. 腹腔注入60-70μL的氯胺酮。

   C. 使用异氟醚系统。

25. 当小鼠处于麻醉状态时心脏跳动越来越慢，钳住脖子使其后脑勺倾斜。仔细的滴入溶液，使液滴从鼻子能通到嘴里，让小鼠嘴也能吸到溶液。

26. 等待小鼠苏醒。鼠三溴乙醇和氯胺酮治疗后需要大约30分钟才能清醒。麻醉持续时间约5分钟后，异氟醚治疗。使用红外线灯暖鼠标，直到它清醒。

注意：如果您使用氯胺酮或三溴乙醇麻醉，等待时间24小时后才能再次麻醉小鼠。重复使用对小鼠可能有害。