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外源ＤＮＡ片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链ＤＮＡ５'磷酸和相邻的3'羟基之间 形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成４个新的磷酸二酯链。但如果质粒ＤＮＡ已去磷酸化，则吸能形成２个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有２个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复。相邻的５'磷酸和３'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的ＤＮＡ连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌ＤＮＡ连接酶和Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶。实际上在有克隆用途中，Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶都是首选的用酶。这是因为在下沉反应条件下，它就能有效地将平端ＤＮＡ片段连接起来。 ＤＮＡ一端与另一端的连接可认为是双分子反应，在标准条件下，其反应速度完全由互相匹配的ＤＮＡ末端的浓度决定。不论末端位于同一ＤＮＡ分子（分子内连接）还是位于不同分子（分子间连接），都是如此。现考虑一种简单的情况，即连接混合物中只含有一种......阅读全文
外源DNA片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链DNA５'磷酸和相邻的3'羟基之间 形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成4个新的磷酸二酯链。但如果质粒DNA已去磷酸化，则吸能形成2个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有2个单链切口，当杂
一、RNA 制备 模板mRNA 的质量直接影响到cDNA 合成的效率。由于mRNA 分子的结构特点,容易受RNA 酶的攻击反应而降解,加上RNA 酶极为稳定且广泛存在,因而在提取过程中要严格防止RNA 酶的污染,并设法抑制其活性,这是本实验成败的关键。所有的组织中均存在RNA 酶,人
目的：了解T4DNA连接酶的几种生物学功能及用途；学习在T4DNA连接酶的作用下，载体与目的基因的几种不同的连接方式以及在标准的连接反应体系中，质粒载体和插入的外源DNA的比率关系和各自的用量；掌握用Pmd18-Tvector与PCR产物进行T-A克隆的机理及其应用。原理：外源DNA片段和线状质粒载
当我们已经获得目的基因片段，选择好适当的克隆（或表达，转化）质粒载体， 并确定重组方案后，下面要进行的就是ＤＮＡ片段之间的体外连接，从而获得重组子。 此重组子可转入相应的宿主菌中用于对目的基因的扩增以及目的基因表达（如现代基因工程药物的生产），还可用于序列分析和转基因等重要生物技术的研究中。&nbs
目的基因的亚克隆所谓亚克隆就是对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆，其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或者进行重组改造等。 亚克隆的基本过程包括：(1)目的DNA片段和载体的制备；(2)目的DNA片段和载体的连接；(3)连接产物的转化；(4)重组子筛选。&n
所谓亚克隆就是对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆，其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或者进行重组改造等。亚克隆的基本过程包括：(1)目的DNA片段和载体的制备；(2)目的DNA片段和载体的连接；(3)连接产物的转化；(4)重组子筛选。 一、试剂准备 1．LB液体培养基：胰化蛋白胨（细
连接反应的策略 可以采用几种策略来进行外源ＤＮＡ片段和质粒载体的连接。对此，可依据外源ＤＮＡ片段未的性质，以及质粒载体与外源ＤＮＡ上限制酸切位点的性质来作出选择。（一）外源ＤＮＡ片段未的性质带有各种未的外源ＤＮＡ的克隆方法见下表：──────────────────────
第一章质粒DNA 的分离、纯化和鉴定 第二章DNA 酶切及凝胶电泳 第三章大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 第四章RNA 的提取和cDNA 合成 第五章重组质粒的连接、转化及筛选 第六章基因组DNA 的提取 第七章RFLP 和RAPD 技术 第八章聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆 第九章分
重组DNA是在体外用限制性内切酶，将不同来源的DNA分子进行特异地切割，获得的目的基因或DNA片段与载体重新连接，从而组成一个新的DNA杂合分子。重组的DNA分子能够通过一定的方式进入相应的宿主细胞，在宿主细胞中进行无性增殖，获得大量的目的基因或DNA片段，此过程称基因克隆。重组的DNA分子也能够在
实验概要所谓亚克隆就是对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆，其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或者进行重组改造等。亚克隆的基本过程包括：(1)目的DNA片段和载体的制备；(2)目的DNA片段和载体的连接；(3)连接产物的转化；(4)重组子筛选。主要试剂1．LB液体培养基：胰化蛋白胨（细菌培养用
第一节 概 述质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆 较小的DNA 片段(＜10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆 ,从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA 和目的DNA 片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可
（一）外源ＤＮＡ和质粒载体的连接反应 外源ＤＮＡ片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链ＤＮＡ５'磷酸和相邻的3'羟基之间 形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成４个新的磷酸二酯链。但如果质粒ＤＮＡ已去磷酸化，则吸能形成２个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的
第一节 概 述质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆 较小的DNA 片段(＜10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆 ,从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA 和目的DNA 片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。但在实
第一节 概 述质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆 较小的DNA 片段(＜10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆 ,从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA 和目的DNA 片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成
实验方法原理 亚克隆的基本过程包括：(1)目的DNA片段和载体的制备；(2)目的DNA片段和载体的连接；(3)连接产物的转化；(4)重组子筛选。
质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA 片段( ＜10kb) 且结构简单，质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆，从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA 和目的DNA 片段，然后体外使两者相连接，再用所得到重组质粒转化细菌，即可完成。但在实际工作中，
实验概要 体外连接获得重组分子，用于转化受体细胞。实验原理 质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段(＜10kb)且结构简单，质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆，从原理上说是很简单的，先
实验方法原理TA克隆 系统由Invitrogen公司（San Diego，CA）发展而来的商业性试剂盒，它用于PCR 产物的克隆 和测序。其原理是利用Taq酶能够在PCR 产物的3'末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3'T突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位
目的基因的亚克隆可应用于：（1）进一步分析目的基因；（2）基因重组。实验方法原理亚克隆的基本过程包括：(1)目的DNA片段和载体的制备；(2)目的DNA片段和载体的连接；(3)连接产物的转化；(4)重组子筛选。实验材料E.coli JM109试剂、试剂盒牛肉膏胰蛋白胨NaCl微量细菌基因组抽提试剂盒
连接反应（一）外源ＤＮＡ和质粒载体的连接反应 外源ＤＮＡ片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链ＤＮＡ５'磷酸和相邻的3'羟基之间 形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成４个新的磷酸二酯链。但如果质粒ＤＮＡ已去磷酸化，则吸能形成２个新的磷酸二酯链。在这种情况
（一）重组T质粒的构建一．原理外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的 DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌
PCR引物决定PCR的特异性，引物的设计就显得尤为重要。下面以已知DNA序列设计引物为例介绍设计引物应考虑的几个方面：1、GC比值：众所周知,碱基对中的GC之间有三条氢键，AT之间有两条氢键，GC和AT在引物序列中的合理比例是设定PCR中退火温度的重要依据。通常在一个引物中GC和AT各半即可。2、长
外源ＤＮＡ片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链ＤＮＡ５'磷酸和相邻的3'羟基之间 形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成４个新的磷酸二酯链。但如果质粒ＤＮＡ已去磷酸化，则吸能形成２个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有２个单链切口，当杂本导
10xT4噬菌体DNA连接酶缓冲液200mmol/L同Tris.Cl(pH7.6)50mmol/K MgCl250mmol/L二硫苏糖醇500μg/ml 牛血清白蛋白（组分Ｖ.Sigma产品）（可用可不用）该缓训液应分装成小份，贮存于－20℃。另外，再设立两个对照反应，其中含有（1）只有质粒载体；（
克隆平末端的目的片段时，为最大量地获得“正确”的连接产物，载体和目的 DNA 在连接反应中的比例必须适当。每一重组体中外源 DNA 的连接方向和插入数量都必须用限制酶酶切图谱分析或其他方法加以鉴定。作为一般规律，如果连接反应中质粒和目的 DNA 摩尔数相等，而且 DNA 的总浓度少于 100 μg/
实验概要本技术以pBS质粒、E. coli DH5α为例介绍了重组质粒的连接、转化及筛选。实验原理本实验所使用的载体质粒DNA为pBS，转化受体菌为E.coli DH5α菌株。由于pBS上带有Ampr 和lacZ基因，故重组子的筛选采用Amp抗性筛选与α-互补现象筛选相结合的方法。因pBS带有Amp
DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA
材料、设备及试剂 一、 材料 外源DNA片段: 自行制备的带限制性末端的DNA溶液,浓度已知; 载体DNA: T-vector(Ampr ,lacZ),自行提取纯化,浓度已知; 宿主菌: E. coli DH5α,或JM系列等具有α-互补能力的菌株。 二、 设备 恒温摇床，台式高速离心机，恒
第二节 材料、设备及试剂一、 材料外源DNA 片段: 自行制备的带限制性末端的DNA 溶液,浓度已知; 载体DNA : pBS质粒(Ampr ,lacZ),自行提取纯化,浓度已知; 宿主菌: E. coli DH5α,或JM系列等具有α-互补能力的菌株。二、 设备恒温摇床，台式高速离心机，恒温水浴锅
质粒克隆操作最费时间的步骤是用电泳的方法对预期大小的外源 DNA 片段和质粒 DNA 片段进行纯化，可以用于将质粒和外源 DNA 的连接在低熔点球脂糖存在的条件下完成实验方法原理质粒克隆操作最费时间的步骤是用电泳的方法对预期大小的外源 DNA 片段和质粒 DNA 片段进行纯化，在以下的方案中（取自S