分子克隆技术(质粒DNA和DNA插入片段的制备、连接反应...2
PCR引物决定PCR的特异性，引物的设计就显得尤为重要。下面以已知DNA序列设计引物为例介绍设计引物应考虑的几个方面：1、GC比值：众所周知,碱基对中的GC之间有三条氢键，AT之间有两条氢键，GC和AT在引物序列中的合理比例是设定PCR中退火温度的重要依据。通常在一个引物中GC和AT各半即可。2、长度：通常15-20bp即可。由于目的不同，有时引物长些，但太短会影响引物的特异性。3、方向：设计出的引物永远是5'-3'方向,所以正向引物是与一股模板DNA序列相一致的，而反向引物则与这股模板DNA序列相互补。4、酶切位点：如果想克隆所放大的DNA片段，通常在引物的5'端设计适当的限制性酶切位点，使进一步的克隆工作更容易。一对引物可用一种或两种酶切位点，这取决于设计者，两种不同的酶切位点使克隆具有方向性。5、启始和终止密码：如果想表达所放大的DNA片段，所用的克隆载体又不含启始密码和终止密码，应将其设计在引物的......阅读全文
分子克隆技术(质粒DNA和DNA插入片段的制备、连接反应...-2
PCR引物决定PCR的特异性，引物的设计就显得尤为重要。下面以已知DNA序列设计引物为例介绍设计引物应考虑的几个方面：1、GC比值：众所周知,碱基对中的GC之间有三条氢键，AT之间有两条氢键，GC和AT在引物序列中的合理比例是设定PCR中退火温度的重要依据。通常在一个引物中GC和AT各半即可。2、长
分子克隆技术(质粒DNA和DNA插入片段的制备、连接反应...-1
克隆（Clone）是指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。分子克隆（Molecular Cloning）是指由一个祖先分子复制生成的和祖先分子完全相同的分子群，发生在基因水平上的分子克隆称基因克隆（DNA克隆）。其基本原理是：将编码某一多肽或蛋白质的基因（外源基因）组装到细菌质粒（
外源DNA和质粒载体的连接反应
外源ＤＮＡ片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链ＤＮＡ５'磷酸和相邻的3'羟基之间 形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成４个新的磷酸二酯链。但如果质粒ＤＮＡ已去磷酸化，则吸能形成２个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有２个单链切口，当杂本导
质粒载体和外源DNA的连接反应
实验概要掌握DNA体外连接的基本技能，了解连接反应的注意事项。实验原理DNA片段之间的连接是通过DNA连接酶的催化实现的。DNA连接酶催化具有平末端或互补粘性末端的DNA片段间相邻碱基通过3’,5’磷酸二酯键连接起来，该反为需能反应，通常需要加入ATP或NADH，DNA连接酶对粘性末端的连接效率要远
外源DNA和质粒载体的连接反应
外源ＤＮＡ片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链ＤＮＡ５'磷酸和相邻的3'羟基之间 形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成４个新的磷酸二酯链。但如果质粒ＤＮＡ已去磷酸化，则吸能形成２个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有２个单链切口，当杂本导
质粒载体和外源DNA的连接反应
实验原理DNA片段之间的连接是通过DNA连接酶的催化实现的。DNA连接酶催化具有平末端或互补粘性末端的DNA片段间相邻碱基通过3’,5’磷酸二酯键连接起来，该反为需能反应，通常需要加入ATP或NADH，DNA连接酶对粘性末端的连接效率要远高于对平末端的连接效率。在基因基因工程实验中，最常用的来源于T
质粒DNA的制备和纯化
实验概要质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1~200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。质粒在细胞内的复制一般有两种类型：
外源DNA和质粒载体的连接反应原理及实验步骤-2
10xT4噬菌体DNA连接酶缓冲液200mmol/L同Tris.Cl(pH7.6)50mmol/K MgCl250mmol/L二硫苏糖醇500μg/ml 牛血清白蛋白（组分Ｖ.Sigma产品）（可用可不用）该缓训液应分装成小份，贮存于－20℃。另外，再设立两个对照反应，其中含有（1）只有质粒载体；（
怎么通过反向pcr技术在质粒中插入一个dna片段
怎么通过反向pcr技术在质粒中插入一个dna片段质粒在你插入的片段上游是有启动子区域的,在插入的时候有时由于是单酶切或者TA克隆或者平末端克隆,你是无法确定基因插入的方向的.如果你插入序列的ATG起始密码子是跟在启动子后面,你就是正向插入,如果你插入序列的终止密码子是在启动子后面,那你就是反向插入了
质粒DNA的小量制备
实验概要本方法用于从细菌中制备提纯少量质粒DNA。主要试剂1. 溶液Ｉ 50mmol/L葡萄糖 25mmol/L Tris．Cl(pH8.0) 10mmol/LEDTA(pH8.0) 溶液Ｉ可成批配制，每瓶约100ml，在6.895×104Pa高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。2. 溶液Ⅱ 0.2