B淋巴细胞膜表面免疫的检查

实验概要

本实验介绍了用直接免疫荧光法检查B 淋巴细胞膜表面免疫球蛋白（SmIg）的基本原理和操作步骤。

实验原理

SmIg 是B  细胞的抗原识别受体，也是B 细胞特异的表面标志，用直接免疫荧光法可检查出SmIg。用荧光素标记的抗Ig  抗体，在一定条件下与淋巴细胞混合，荧光素标记的抗Ig 抗体可以与B 细胞表面的Ig 结合，在荧光显微镜下观察可见B  细胞膜上出现荧光。此方法可用来鉴定B 淋巴细胞。

主要试剂

1. 异硫氰酸荧光素（FITC）标记的兔抗小鼠Ig 抗体（购自BD 公司）
2. Hank's液：pH7.4(内含0.1%NaN₃)

主要设备

1. 台式离心机
2. 离心管

3. 吸管

4. 移液管等

实验材料

ICR 小鼠

实验步骤

1.  采用颈椎脱臼法处死小鼠，解剖取出脾脏放入盛有6ml Hank's液的平皿中，用100  目钢网研磨，混匀。从中吸取1ml细胞悬液放入一试管中，加满Hank's液，离心1000rpm，10  分钟，洗涤细胞一遍。倾去上清，沉积的细胞恢复1ml容积，即为约1×10⁷/ml的细胞悬液。另取一支试管，吸取1×10⁷/ml的细胞悬液0.4ml加Hank's液3.6ml，即为1×10⁶/ml的细胞悬液。
2. 取2ml离心管两只，各加入1×10⁶/ml的细胞悬液1ml，用台式离心机离心2000rpm，3 分钟，弃去上清液。一支加入荧光素标记的兔抗鼠Ig抗体100μl，另一支不加抗体作对照，置4℃冰箱30 分钟。
3. 取出离心管，用Hank's 液洗涤细胞两次，以去除游离的抗体，最后一次离心后弃去上清液，留少许回流液，混匀，滴片，用荧光显微镜观察。
4. 实验结果
荧光显微镜观察，落射激发光下SmIg 阳性细胞可见环状或斑点状荧光。用钨丝灯光源透射光照明计数同一视野内淋巴细胞总数，共计数200～300 个淋巴细胞，算出其中SmIg 阳性细胞的百分数。

注意事项

在滴片前要彻底去除游离的抗体，以避免假阳性结果。

附    件   (共1个附件,占63KB)

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