CIB2／CIB3蛋白对通道的特性具有调控作用

　　机械力电转导（Mechanoelectrical transduction, MET）是将机械刺激转换成电化学信号， 这一过程对于生物体感知触觉、听觉及许多生理过程十分重要（相关背景，详见BioArt此前的报道：Neuron | 邱徐峰等证明TMIE蛋白是耳蜗毛细胞机械力电转导通道的必要组成亚基；特别推荐Neuron | 唐逸泉博士解析听觉受体如何感受机械力刺激——兼谈五种感觉受体（视听嗅味触）研究小史；Neuron | 闫致强团队确立听觉首要机械力门控离子通道，五种感觉受体的最后一个谜团被解开）。感知声音的关键步骤在于耳蜗毛细胞纤毛（hair bundle）的机械力转导通道MET通道将声波产生的机械振动信号转化成电信号。近年来的研究表明，TMC1 和TMC2最有可能是直接介导毛细胞机械转导的通道蛋白（Pan et al., 2013； Pan et al., 2018； Jia et al., 2020），然而听觉机械力转导MET通道包含哪些具体蛋白与其如何感应机械刺激以及机体如何对MET通道进行调控并未被完全揭示。

　　除了TMC1和TMC2，其他一些蛋白的缺失或突变（LHFPL5，TMIE，PCDH15，CDH23，CIB2等）也严重的影响听力(Siemens et al., 2004； Kazmierczak et al., 2007； Xiong et al., 2012； Zhao et al., 2014； Giese et al.,2017； Cunningham et al., 2020)；目前的研究结果已经陆续揭示这些蛋白在MET中的功能与机制(Fig 1)。比如，PCDH15与CDH23是Tip link的组成部分；TMIE作为MET通道的一个调控亚基，其N端参与了机械门控，C端结合TMC1/2蛋白和PIP2等磷脂并直接影响MET通道特性；LHFPL5是MET通道复合物的组份并且影响PCDH15组装到Tip link。先前的研究表明，CIB2对于听觉MET是必不可少的，但是其对于MET的具体作用机制并不完全清楚。在线虫的研究中表明，TMC蛋白通过CIB2 和ankyrin锚定于细胞骨架上（Tang et al., 2020）。

　　约翰霍普金斯大学Ulrich Müller课题组致力于研究毛细胞MET machinery 分子组成及毛细胞感知机械振动的分子机制，在hair cell听觉感知与机械力转导领域做出了突出贡献。

　　2021年6月4日，Müller课题组与哥伦比亚大学Lawrence Shapiro课题组合作在Neuron发表题为“CIB2 and CIB3 are auxiliary subunits of the mechanotransduction channel of hair cells”的研究，进一步证明CIB2/CIB3蛋白是耳蜗毛细胞MET通道的辅助亚基，其对通道的特性具有调控作用。

　　CIB2/CIB3蛋白是CIB家族(包括CIB1-4)中的两个成员，分别在耳蜗和前庭毛细胞中有着不同的定位。研究人员首先通过在cib2敲除鼠耳蜗毛细胞中过表达CIB蛋白发现，CIB2 和CIB3 都能rescue MET电流，暗示CIB2 和CIB3 在MET有着相似的功能。

　　研究人员进一步通过精细的突变及相互作用分析发现，CIB2/3除了结合已经报道的TMC1 N末端区域外，与TMC1 LOOP1区域也有很强的相互作用，且与LOOP1区域相互作用远强于N端区域。CIB2/3与TMC1新的相互作用区域的发现，可能会带来CIB2/3蛋白新的功能与机制的了解。

　　那么CIB2/3是如何影响MET电流？它是否作为调控亚基直接参与调控MET通道的功能呢？为了揭示这个问题，研究者根据CIB2致聋突变，使用CRISPR/Cas9 技术制作了数个CIB2突变小鼠。通过免疫荧光染色标记内源性TMC1 和TMC2， 研究人员惊奇地发现CIB2 能直接影响TMC1/2在静纤毛上的定位，并且不同的CIB2 突变对于TMC1和TMC2定位有着不同的调控。电生理实验表明，CIB2突变体显著损害了MET电流，并且改变了通道的静息开放概率（resting open probability）,但并没有改变电流的adaptation。

　　接下来，作者感兴趣，CIB2/3在机械力转导通道中是如何发挥作用的，CIB2/3与TMC1蛋白作用区域的构象是什么样的。遗憾的是，研究者并未成功获得CIB2及CIB2/TMC1的结构, 但顺利通过X-ray crystallography 获得了CIB3及CIB3/TMC1-peptide复合物晶体结构。通过同源结构建模发现，CIB2与CIB3有高度类似的结构。

　　通过序列比对，研究人员发现，CIB2/CIB3与NCS家族的KChIP1蛋白有很高的序列相似性。并且，比较CIB3与KChIP1结构，发现他们都有一个疏水的沟；而比较CIB3/TMC1共晶体结构与KChIP1/Kv4共晶体结构，发现CIB3与KChIP1均使用这个大的疏水沟结合TMC1及Kv4(Zhou et al., 2004； Wang et al., 2007)。

　　总之，该研究综合运用了生物化学，细胞生物学，小鼠遗传学，CRISPR/Cas9 技术，电生理以及结构生物学手段，证明CIB2/CIB3以一种类似KChIP1调控Kv4的方式，调控TMC蛋白在耳蜗毛细胞的亚细胞定位，并作为辅助亚基对机械力转导通道有调控作用。