CRISPR／Cas9蛋白切割DNA过程中的调控和校验机制

　　清华大学生命科学学院陈春来研究组在《Cell Reports》杂志发表了研究论文，题目为“The Conformational Dynamics of Cas9 Governing DNA Cleavage Are Revealed by Single-Molecule FRET”（利用单分子FRET揭示Cas9在DNA切割过程中的动态构象）。该论文展示了Cas9可以自发地在三种主要构象中转换，揭示了Cas9蛋白与PAM远端DNA/RNA双链相互作用可长程别构调控Cas9切割结构域的局部构象，这是Cas9切割靶标DNA之前的最后校验步骤。最后，该文提出了优化和设计高保真Cas9的新思路，即通过突变Cas9蛋白以影响这种长程别构调控机制，可提高Cas9的识别特异性。

　　CIRSPR/Cas9是一种可以由一条单链sgRNA（single guide RNA）指导的利用Cas9核酸酶对靶向DNA进行特异性识别和切割的技术。由于其可以高效快捷地靶向切割DNA而被广泛地应用于基因编辑、基因表达调控、基因定位和成像等领域。但是，Cas9的脱靶效应严重阻碍了其应用。尽管有一些研究报道了通过改造Cas9和截短sgRNA来提高其特异性，但仍然缺乏对Cas9切割靶标DNA的详细分子机制的全面认知，因而难以对CIRSPR/Cas9的优化提供系统性的指导。

　　单分子荧光共振能量转移技术（FRET）是检测生物大分子构象变化的有利工具。该研究通过在Cas9蛋白的特异位点上标记荧光团，基于全内反射荧光显微镜快速灵敏地捕捉单个Cas9分子的FRET效率变化以及在每个FRET状态的停留时间，以此反应Cas9的构象变化，并提供该过程中的一系列动力学参数。该研究发现，Cas9展现出三种构象状态，并可以自发的在这三种状态中自由切换。靶标序列的PAM远端与sgRNA的大于三个碱基的错配，导致Cas9的HNH结构域（核酸切割结构域）稍偏离了其正确切割位点，因而将其从切割活性态转化为非活性状态。而这种对错配的校验机制是Cas9蛋白与PAM远端DNA/RNA双链相互作用对其HNH结构域的长程别构调控来实现的。

Cas9蛋白切割靶标DNA的动态动态构象和校验机制模型

　　通过对Cas9一些高保真突变体的研究，该文章证明了在Cas9/RNA/DNA三聚复合物中引入额外的能量损耗导致Cas9切割底物的能垒升高，从而提高了Cas9切割特异性。该文章为优化Cas9特异性提供了新思路，即通过减弱Cas9与PAM远端DNA/RNA异源双链的相互作用来提高切割能垒，从而达到提高特异性的目的。

　　清华大学生命科学学院陈春来研究员为本文通讯作者。清华大学生命学院CLS项目三年级博士生杨梦铱，清华大学生命学院三年级直博生彭思佳为共同第一作者。本工作获得了北京结构生物学高精尖创新中心、清华-北大生命科学联合中心及国家自然科学基金委的经费支持。