DNA单链断裂检测技术：单细胞凝胶电泳（SCGE）检测原理..

DNA单链断裂检测技术：单细胞凝胶电泳（SCGE）检测原理和操作步

放回玻片托盘中待琼脂糖凝固。
（3）裂解：
移开盖玻片，将载玻片缓慢浸入新配制的冰凉的细胞裂解液中，置于4℃冷藏至少1h。细胞可在裂解液中至少保存4周，但时间太长可能会引起缓冲液沉淀。
碱性细胞裂解液配制（每1000ml）方法：
a、2.5mol/L NaCl 146.1g；
b、100mmol/L EDTA 37.2g；
c、10mmol/L Tris 1.2g；
d、用约12g NaOH 调至pH值为10；
e、1%肌氨酸钠10g；
f、用去离子水定容至890ml，过滤除菌，为储备液，室温保存；
g、加新配1%Triton X-100和10%DMSO为应用液，在应用前冷藏30-60min。
中性细胞裂解液配制方法：
a、2mol/L NaCl 117g；
b、30mmol/L EDTA 12.4g；
c、10mmol/L Tris 1.2g；
d、用约12g HCl 调至pH值为8.2-8.5；
e、1%肌氨酸钠10g；
f、用去离子水定容至890ml，过滤除菌，为储备液，室温保存；
g、加新配1%Triton X-100和10%DMSO为应用液，在应用前冷藏30-60min。
（4）电泳：
将冷藏1h后的载玻片从细胞消化液中轻轻取出，并列置于水平凝胶电泳槽中阳极端附近，载玻片间不留空隙。
向电泳槽中加入新配制的电泳缓冲液应用液，使液面完全覆盖载玻片。应防止在琼脂糖上产生气泡。
将载玻片在碱性缓冲液中放置20-60min，让DNA在电泳前解螺旋和产生碱性易损性损伤。时间越长，损伤表现得越充分。
在室温下，置电压25V，调整电泳槽中缓冲液液面高度使电流为300mA，根据研究目的会对照样品的迁移情况，电泳10-40min。不同类型的细胞电泳时间不同。
碱性电泳液应用液（1000ml）：
a、300mmol/L NaOH 12g；
b、1mmol、L EDTA 372.24g
c、称取上述试剂后，用1000ml去离子水融解（pH>13）备用，注意在临用前现配。
中性电泳缓冲液应用液（0.5%TBE）：
a、2mmol/L EDTA；
b、90mmol/L Tris；
c、90mmol/L 硼酸；
d、调pH 8.2-8.5，注意在临用前现配。
（5）中和：
切断电源，将载玻片置染缸，用中和缓冲液浸洗，每次5min。晾干，重复2次。目的是防止碱液和去污剂干扰溴化乙锭染色。
中和缓冲液（0.4mol/L Tris）:
a、Tris 48.5g；
b、加去离子水定容至1000ml；
c、用>10mol/L HCl调pH值至7.5，室温储存。
（6）溴化乙锭染色：
呈中性后，晾干载玻片，将玻片用0.5ulEB应用液染色，盖上新盖玻片。
溴化乙锭（EB）染液（10 x储备液，即20ug/ml）；
a、溴化乙锭 1mg；
b、去离子水 50ml；
c、室温贮存，临用时见储备液稀释10倍。
EB为诱变剂，小心操作。
注意：以上（1）-（3）步应在黄色、红色灯光下或暗处进行，以免额外DNA损伤，载玻片可在潮湿环境中保存72h，但最好在24h内读片。
（7）镜检姐结果评价：
EB染色后的DNA样品应尽快在荧光显微镜下观察。未受损细胞表现为一圆形荧光核心，即彗星头部，没有尾巴。而受损细胞则有彗星尾从核中伸向阳极，形成一个亮的荧光头部和尾部。用目镜测微尺测定或拍摄X 400黑白显微照片再作测定。每隔样品中至少随机挑选25个细胞测定。测定受试组合对照组核DNA直径和DNA迁移长度，再用透明尺测量彗星迁移部分的面积。也可测其斜度和峭度，因不受试物引起的彗星形状可有差异。
统计时，比较受试组和对照组之间的彗星尾长，或计算受试组（T）与对照组（C）彗星尾长之差（T-C）即T-C<10um（一）；10-20um（±）；20-40um（±）；>40um(++).另外，也可计算各族受损细胞率，即彗星尾长<35um为未损伤；35-70um为中度损伤；>70um为重度损伤，此值在不同细胞稍有差异。