DNA片段的回收实验

DNA片段

纯化试剂盒 异丙醇

离心机 电泳仪 电泳槽 取液器 微量真空装置 抽滤装置

一、从琼脂糖介质中纯化DNA片断

1.  用低熔点或常规熔点琼脂糖电泳对PCR扩增片断进行分离，该电泳安常规方法进行，缓冲液为TAE。

2.  在凝胶上，找到所需条带，然后用洁净并灭菌的小刀将其切下接近300微升琼脂糖凝胶 （约300毫克）

3.  如果切下的琼脂糖为高融点的则安下面A步骤进行，如为低融点琼脂，则安B步骤进行。

A.  将300微升琼脂块放进1.5毫升的微量离心管中，加入1毫升纯化用树脂，然后将其置于65℃水浴保温5分钟，或保温至琼脂完全溶解。

B.   将300微升琼脂块放进1.5毫升的微量离心管中，然后将其置于70℃水浴保温至琼脂完全溶解，然后加入1毫升纯化用树脂到融化好的琼脂中，将其混合20秒，但不要振动。

4.  为每一个待回收片断准备好一个微量柱。 在每个柱的开口处，联上一针筒，然后将这些柱与针筒的复合体与抽真空设备相连

5.  在柱-针筒复合体中加入树脂/DNA混合物，打开真空装置，将树脂与DNA的混合物抽到微量柱中，断开真空装置与柱的连接。

6.  洗柱，加入2毫升80%的异丙醇，打开真空装置，使这些洗柱液完全流经微量柱。

7.  继续真空30秒以干燥树脂，注意此干燥时间不能超过30秒。关闭真空，移去针筒。将微量柱转移至一1.5毫升微量离心管中。10 000 g 离心2分钟，以彻底除去残存的异丙醇。

8.   将微量柱，再转移至一新的1。5毫升微量离心管中，加入50微升水或TE缓冲液，静置1分钟（在头30秒，DNA仍将吸附于柱上）， 10 000 g 离心20秒，以洗脱DNA片断，所得纯化后的DNA片断可直接用于连接反应或在-20℃保存。

二、尿素丙烯酰胺变性胶中分离DNA片断

1.  从变形胶上切下待回收片断，将其放如一微量离心管中。

2.  加入100微升TE缓冲液，37℃保温30分钟以上。

3.  将上清液吸入一新管中，加入1毫升树脂，振荡20秒以混匀树脂与清液。

1.  对于>3 Kb 的片断在纯化回收时，洗脱前，如先将水或TE缓冲液预热到65-80℃，则将能有效的提高回收率。待洗脱片断>3 Kb 时，洗脱液温度应为65-80℃；待洗脱片断>20 Kb 时，洗脱液温度应达80℃。

2.  应用TAE缓冲液，而不应用含TBE的胶，因硼酸能与琼脂糖中的方式糖单体或多聚体结合成难溶复合物，这种复合物使胶难熔解。

3.  在取用纯化柱树脂中的液体前，应将树脂充分搅匀，如树脂中出现结晶或结块，则应将树脂在25-37℃，温热10分钟，冷却至30℃使用。树脂本身不会溶。

4.  在紫外光下观察切割条带时，操作要快，DNA条带在紫外光下的暴露时间应尽量短，因UV会引起DNA变异。