ELISA实验

抗原 血清

碳酸盐包被缓冲液 PBST BSA

96孔酶标板 4℃冰箱 恒温培养箱 分光光度计

一、包被抗原

1. 用50mM 的碳酸盐包被缓冲液（pH 9.6）溶解抗原，使抗原浓度为10-20 μg/ml，加100 μl/孔到96 孔酶标板，4℃放置过夜。

2. 第二天弃去包被液后，用PBST 洗涤3 次，每孔加入150 μl 1％ BSA 37℃封闭1 小时。

3. PBST 洗涤3 次后，每孔加入100 μl 不同倍比稀释度的血清，并加入对照样品，37℃孵育2 小时。

4. PBST 洗涤5 次后，加入100μl 稀释后的HRP 标记的二抗，37℃孵育1 小时。

5. PBST 洗涤5 次后，显色剂显色20 min 后，酶标仪上读取A405 吸收值。

二、包被细胞 

1. 在96 孔培养板上接种细胞数为1 x 104 cells/well，37℃过夜培养。

2. 第二天用PBS 洗涤培养板2-3 次。

3. 加入125 μl/well 10% Forma lin（1:10 稀释）, 室温下固定15 min。

4. 用ddH2O 洗涤培养板3 次，并晾干，储藏在2-8℃备用。

5. 用PBST 洗涤3 次，每孔加入150 μl 1％ BSA 37℃封闭1 小时。

6. PBST 洗涤3 次后，每孔加入100 μl 不同倍比稀释度的血清，并加入对照样品，37℃孵育2 小时。

7. PBST 洗涤5 次后，加入100 μl 稀释后的HRP 标记的二抗,37℃孵育1 小时。

8. PBST 洗涤5 次后，显色剂显色20 min 后，酶标仪上读取A405 吸收值。50mM 的碳酸盐包被缓冲液：0.05mol/L pH9.6 碳酸缓冲液,4℃，保存,Na2CO3 0.15 克, NaHCO3 0.293 克,蒸馏水稀释至100 ml。                                                                                                                    

ABTS 作为底物进行显色反应(10ml)：

 0.2M Na2HPO4 2.4ml

 0.1M 柠檬酸2.6ml

ddH2O 5ml

ABTS 5mg

H2O2(30%) 4 ul（用前加入）

血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。一般说来，在5天内测定的血清标本可放置于4℃，超过一周测定的需低温冰存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，可上下颠倒混和，不要在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂。

按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。ELISA中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用pH计测量较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。