综上所述，尽管ELISA测定的操作步骤非常简单，但有可能会影响测定结果的因素却较多，分布在测定操作的各步之中，尤以加样、温育和洗板为甚。为帮助大家分析查找测定中出现问题的可能原因，特对常见问题及原因归纳总结于下表。
操作过程中可能出现的问题和解决方法
| 问题 | 可能原因 | 解决方法 |
|---|---|---|
| 显色淡，灵敏度偏低 | 1、试剂盒在运输途中时间太长，温度太高 | 尽量缩短运输时间，夏季应放冰块降温 |
| 2、试剂盒未充分平衡 | 试剂盒从2～8℃冰箱取出后打开盒盖，于室温平衡至少20分钟，确保所有试剂已平衡至室温（约25℃）。 | |
| 3、培养箱温度不足37℃ | 注意培养箱温度，放入反应板后尽量减少开启次数以免影响温度恒定，非隔水式培养箱尤其应注意 | |
| 4、保温时间不足 | 校正定时钟准确定时 | |
| 5、洗涤时冲击力太大、浸泡时间过长、洗涤次数增加 | 按说明书要求保留洗涤时间，准确记住洗涤次数 | |
| 6、移液器吸液量不足，吸嘴内壁挂水太多或内壁不清洁 | 校正移液器，吸嘴要配套，装吸嘴时要紧密，吸嘴内壁要清洁，最好一次性使用 | |
| 7、蒸馏水水质有问题 | 使用新鲜合格的蒸馏水 | |
| 8、底物作用时间不足 | 准确定时 | |
| 背景深，全部呈有色, | 1、洗涤不充分，洗后未拍干，样品中其它成分残留或酶标记物残留 | 浓缩洗液准确配制；10倍浓缩洗涤液如有结晶则应让结晶于室温全部溶解后再量取稀释；充分洗涤，彻底拍干。加样或加酶拍板的滤纸应弃去不用，不要反复使用，否则易造成污染 |
| 2、样品污染 | 样品应新鲜采集，或低温保存，防止污染 | |
| 3、培养箱温度超过37℃或反应时间过长 | 调整培养箱温度，准确定时 | |
| 4、吸嘴重复使用，未洗净或消毒不彻底 | 吸嘴尽可能一次性使用 | |
| 5、蒸馏水被污染 | 使用新鲜蒸馏水 | |
| 6、酶等试剂混用 | 不同批号试剂勿混用 | |
| 7、一次实验的标本量过多，加样时间太长，导致实际反应时间延长 | 合理安排实验，避免几块酶标板同时加样 | |
| 重复性不佳 | 1、样品数量多少不一，加样时间有长有短 | 重复某一样品时，加样时间尽可能与第一次接近 |
| 2、保温时间不一致，洗涤条件不一致，操作人员不一致 | 重复测定标本，操作条件、人员等应尽可能与上次保持一致，以排除这些因素造成的不一致的可能性 | |
| 3、加样量不一致 | 样品稀释前应充分混匀，尽可能使用同一移液器并装紧吸嘴 | |
| 出现白板，阳性对照不显色 | 显色液变质 | 更换新的显色液 |
| 洗涤液配制有误 | 请按说明书所示稀释倍数配制 | |
| 未加酶结合物而认为已加入 | 注意不要漏加 | |
| 终止液误作洗涤液稀释或当底物液使用 | 每次加液前均应看清标签 |
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