ELISA检测噬菌体抗体与目的抗原的亲和力

实验概要

本实验利用ELISA检测了噬菌体抗体与目的抗原的亲和力。

主要试剂

1. 0.5mol/L Na₂CO₃(pH9.6)

2. 1％BSA

3. HRP标记的抗M13噬菌体多抗

4. 2mol/L H₂SO₄

主要设备

1. 酶标板

2. 酶标仪

实验步骤

1. 将抗原用PBS或0.5mol/L Na₂CO₃(pH9.6)稀释至10μg/ml；

2. 对于要检测的每个克隆，至少包被2个孔，每孔用200μl稀释抗原。同时包被阴性对照抗原。此外，包被阳性对照抗原，阳性对照抗原用anti-M13抗体；

3. 室温包被1～2h，最好于4℃过夜包被，甩掉孔中液体，倒置于纸巾上空干。

4. 每孔中用至少200μl 1％BSA封闭，37℃1h。去掉液体后空干。

5. 将重组噬菌体事先用等体积的封闭液于室温下封闭15min～30min，以封闭各种蛋白质之间的非特异性结合位点。

以M13噬菌体作为阳性对照噬菌体，也按上述步骤操作。

6. 在每个包被抗原孔中，加入稀释的重组噬菌体悬液200μl，37℃ 1～2h。在包被了阳性对照抗原的孔中，加入200μl阳性对照噬菌体。

7. 去掉孔中液体，倒置于纸巾上。将板浸入PBS/0.5％ Tween20(PBST)中，振荡赶走气泡，将板取出。重复洗涤５遍。

8. 将板倒置于纸巾上，去掉所有液体。

9. 将HRP酶标的Anti-M13抗体用封闭缓冲液稀释至合适浓度。

10. 在每孔中加入200μl HRP/Anti-M13稀释液。

11. 37℃温育1h。按前述方法洗涤6次。

12. 每21ml 1×ABTS底物溶液中加入36μl 30％ H₂O₂。在每孔中加入200μl。

13. 置室温20～60min，直至出现适中的颜色反应。加入2mol/L H₂SO₄终止反应。

14. 于415nm波长下用酶标仪读出光吸收值。良好的数据中，噬菌体抗体与筛选抗原的吸收值应当比阴性对照抗原的吸收值高2～3倍。