ELISA检测方法之双抗体夹心法测抗原|实验

对于含多个抗原决定簇的大分子蛋白，使用双抗体夹心ELISA模式测定相当简便，现有的商品试剂盒基本上都采用此种测定模式。具体测定方法如下：

1．首先以双抗体之一于碳酸盐缓冲液中4℃下过夜包被聚苯乙烯等固相，形成固相抗体，洗涤去除未与固相结合或结合不紧的抗体后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封闭，洗涤去除未结合的部分及杂质。

2．加入含待测物的临床样本如血清等，温育一定时间后洗板；此时，待测抗原就会与固相上特异抗体反应而吸附于固相上。

3．加入酶标记的双抗体之二，温育一定时间后洗板；此时，在固相上即形成双抗体与特异抗原的夹心产物。

4．加入酶底物，温育显色测定(图2—1)。

在该测定模式中，有两步温育和板孔洗涤步骤，如果将上述测定步骤2和3并为一步，即将待测样本和酶标抗体同时加入，从而仅有一步温育和洗板过程，即为通常所说的“一步法”。最初的双抗夹心ELISA试剂盒，均采用两步法。后来，人们为了节省时间，简化操作步骤，试剂生产厂家逐步推出了“一步法”试剂盒。目前在我们的临床实验室中，测定大分子抗原如HBsAg、。FP和hCG等，基本上都采用一步法。一步法相比于两步法，虽然操作简单‘但有其固有的缺陷，处理不好，对ELISA测定结果有严重影响。

在通常的两步温育洗涤方法中，抗原抗体反应将遵循下述规律，即在第一步中加入的待测标本中抗原(Ag)浓度逐步增加时，将使固相抗体(Ab)与抗原的结合逐步达到饱和[(1)式]，这样当随后加入一定浓度的酶标抗体(Ab’)后，a复合物的形成将直接与在第一步中形成的b复合物相关[(2)式]，因此，待测抗原浓度的逐步增加导致了显色的逐步加深，当抗原浓度增加到一定程度时，反应显色达到平台，而呈S形变化曲线。

而一步法双抗夹心ELISA的反应曲线则为钟形曲线(图2—3)。也就是说测定显色随着待则标本中抗原浓度的增加而升高至一定程度后，测定吸光度即随抗原浓度的增加而开始下降直至不显色，即所谓的“钩状效应”(hook eHect)，也就是我们在免疫沉淀试验中所称的“带现象”(zonephen。menon)。一步法的反应平衡式如(3)式

此外，b和c复合物的增加亦使得“双抗体夹心复合物”难以形成。但如果 固相单抗和标记单抗采用针对抗原的不同且空间距离较远的决定簇的抗体，即包被使用一种 单抗，酶标记使用另一种单抗，同时充分混匀反应液，并适当延长反应温育时间，则可使b，。和 d复合物减少至最低程度，而大大减轻“钩状效应”。

我们曾使用本室能得到的含最高浓度(约2mg／m1)HBsAg的血清样本对目前国内较大的试剂生产厂家的“一步法”HBsAg测定ELISA试剂盒的“钩状效应”进行了评价，尽管大部分有在HBsAg最高浓度下的测定显色较次高浓度(1：lo稀释)显色要浅的现象，但均未出现该份样本测定为阴性的情况。尽管如此，在临床实际工作中，仍有可能遇到“钩状效应”较严重的HBsAg测定ELISA试剂盒，我们也经常听到基层实验室同行在这方面的反映。因此，大家还应该重视这方面的问题·，当发现测定结果明显与临床不符或与相关测定指标互有矛盾，如 HBeAg阳性样本HBsAg测定为阴性时，就应考虑HBsAg测定可能存在的“钩状效应”问题。

综上所述，一步法ELISA试剂盒作为迎合临床实验室简便快速要求的产物，有着巨大的市场，其虽有潜在缺陷，易导致含高浓度待测物的标本检测为阴性(假阴性)，但精心的实验设计，对包被和酶标记抗体仔细选择，完全可以将“钩状效应”出现的可能性降至最低。此外，建议生产HBsAg，aFP和hCGELISA"一步法”测定试剂盒的厂家，应对所产的试剂在出厂前对其“钩状效应"(hookeffect)进行充分的研究，并提醒用户在使用时应注意之处。

双抗体夹心法测抗原另一个所需要注意的是类风湿因子(RF)的干扰。我们知道，RF是一种抗变性IgG的自身抗体，主要为19S的IgM类抗体，也可见7S的IgG及IgA类抗体。这种自身抗体的特性是其是能与多种动物的变性IgG的Fc部分结合。因此，如果血清标本中含有RF，在双抗夹心ELISA检测时，其即可作为固相抗体和酶标抗体(均为IgG)之间的桥接抗原，而产生假阳性反应。因此，如果使用抗体的Fab2：或Fab片段作为酶标记用抗体，则可避免RF的干扰。