ELISA样品制备指南

实验概要

掌握ELISA样品制备的基本方法。

主要试剂

1. 细胞/组织提取缓冲液配方

    1) 100 mM Tris, pH 7.4

    2) 150 mM NaCl

    3) 1 mM EGTA

    4) 1 mM EDTA

    5) 1% Triton X-100

    6) 0.5% 脱氧胆酸钠

2. 制备完全提取缓冲液所需的其它试剂

    1) 磷酸酶抑制剂混合物

    2) 蛋白酶抑制剂混合物

    3) PMSF

注意：使用前，用如制造商所述的磷酸酶和蛋白酶抑制剂混合物以及 PMSF 将细胞提取缓冲液补充至 1mM。

实验步骤

1. 细胞培养物上清液

将细胞培养基移至离心管，并在 4℃下以 1,500 rpm 离心 10 分钟。立即等分上清液并在 -80℃下保存样品。尽可能减少冻融循环次数。

2. 细胞提取物

    1) 将组织培养板放置在冰上

    2) 吸出培养基并且用冰冷的 PBS 轻轻洗涤细胞一次

    3) 吸出 PBS 并且每 100 mm 培养板添加 0.5 ml 完全提取缓冲液

    4) 剥离细胞，收集在倾斜板中，然后移至预冷管中

    5) 短暂涡旋并在冰上孵育 15-30 分钟

    6) 在 4℃下以 13,000 x rpm 离心 10 分钟，沉淀不溶性内容物

    7) 将上清液（这里是指可溶性细胞提取物）等分至冰上干净的冷却管，然后在 -80℃下保存样品。尽可能减少冻融循环次数。

3. 条件培养基

将细胞接种到完全（含血清）生长培养基中，使细胞增殖到所需汇合度。弃去生长培养基并用几毫升温热 PBS 小心洗涤。重复洗涤步骤。弃去最后的 PBS 洗涤液并小心添加无血清生长培养基。孵育 1-2 天。将培养基移取至离心管，并在 4℃下以 1,500 rpm 离心 10 分钟。立即等分上清液并在 -80℃下保存样品。尽可能减少冻融循环次数。

4. 奶乳

收集样品并在 4℃下以 10,000xg 离心 2 分钟。等分上清液并在 -80℃下保存样品。尽可能减少冻融循环次数。

5. 血浆

将全血收集到含抗凝血剂的管中，例如 BD 抗凝真空采血管（目录号：363080/363080）或添加 0.1M 柠檬酸钠至 1/10 终体积。在 4℃下以 3000 rpm 离心 10 分钟。立即等分上清液（血浆）并在 -80℃下保存样品。尽可能减少冻融循环次数。

6. 尿液

收集样品并在 4℃下以 10,000xg 离心 2 分钟。等分上清液并在 -80℃下保存样品。尽可能减少冻融循环次数。

7. 唾液

收集样品并在 4℃下以 10,000xg 离心 2 分钟。等分上清液并在 -80℃下保存样品。尽可能减少冻融循环次数。

8. 血清

将全血收集到未经处理的测试管中，或者如不含抗凝血剂的管，例如 BD 血清用真空采血管（目录号：367812）。在室温下不受干扰地孵育 20 分钟。在 4℃下以 3,000 rpm 离心 10 分钟。立即等分上清液（血清）并在 -80℃下保存样品。尽可能减少冻融循环次数。

9. 组织提取物

    1) 用干净的工具切割所关注的组织，最好在冰上进行，并应尽可能快以防止被蛋白酶降解。

    2) 将组织置于圆底的微量离心管中，并浸入液氮中进行“速冻”。将样品保存在 -80℃下以便后续使用或放置在冰上进行直接匀浆。

    3) 对于约 5 mg 的一片组织，需要向管中添加约 300 µl 完全提取缓冲液（查看细胞/组织提取缓冲液配方），然后用电动匀浆器匀浆。

    4) 清洗刀片两次，每次清洗使用 300µl 完全提取缓冲液，然后在 4℃下维持恒定搅拌 2 小时（例如置于冷室中的回旋振荡器上）。

    5) 在 4℃下以 13000 x rpm 离心 20 分钟。置于冰上，将上清液（这里是指可溶的蛋白质提取物）等分至新的冷却管中并在 -80℃下保存样品。尽可能减少冻融循环次数。

注意：裂解缓冲液的体积必须根据存在的组织数量确定。最终蛋白质提取物的典型浓度 > 1 mg/ml。