GB／T189792003食品中黄曲霉毒素的测定（二）

取样品洗脱液1.0mL加入重蒸馏水定容至2.0mL，用进样器吸取100mL注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定试样的响应值（峰高或峰面积）。经过与黄曲霉毒素标准液谱图比较响应值得到试样中黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁和G₂的浓度 。

2.4.4 空白试验

    用水代替试样，按2.4.1~2.4.3步骤做空白试验。

2.4.5 结果计算

检测结果按公式（1）计算：

                        …………（1）

式中： — 试样中黄曲霉毒素（B₁、B₂、G₁或G₂）的含量，mg/kg；

      — 试样中黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁或G₂的含量，mg/L；

      — 空白试验黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁或G₂的含量，mg/L；

      — 最终甲醇洗脱液体积，mL；

      — 最终净化洗脱液所含的试样质量，g；

      — 试样称取量，g；

      — 样品和提取液总体积，mL；

      — 稀释用样品滤液体积，mL；

      — 稀释液体积，mL；

      — 通过亲和柱的样品提取液体积，mL。

    黄曲霉毒素总量为B₁、B₂、G₁、G₂个别浓度之和，即B₁+B₂+G₁+G₂。

注：计算结果需扣除空白值。

计算结果表示到小数点后2位。

3 免疫亲和层析净化荧光光度法

3.1 方法提要

试样经过甲醇-水提取，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和层析净化，此抗体对黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂具有专一性，黄曲霉毒素交联在层析介质中的抗体上。用蒸馏水将免疫亲和柱上杂质除去，以甲醇通过免疫亲和层析柱洗脱，加入溴溶液衍生，以提高测定灵敏度。洗脱液通过荧光光度计测定黄曲霉毒素（B₁+B₂+G₁+G₂）总量。

3.2 试剂和溶液

3.2.1甲醇（CH₃OH）：色谱纯

3.2.2甲醇-水（7+3）：取70mL甲醇加30mL水

3.2.3 甲醇-水（8+2）：取80mL甲醇加20mL水

3.2.4甲醇-水（45+55）：取45mL甲醇加55mL水

3.2.5 苯：色谱纯         不要去掉

3.2.6乙腈：色谱纯

3.2.7苯-乙腈（98+2）：取2mL乙腈加98mL苯

3.2.8氯化钠（NaCl）

3.2.9磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）

3.2.10磷酸二氢钾（KH₂PO₄）

3.2.11氯化钾（KCl）

3.2.12  溴溶液储备液（0.01%）：称取适量溴，溶于水，配成0.01%的储备液，4℃避光保存。

3.2.13  溴溶液工作液（0.002%）：取10mL 0.01%的溴溶液加入40mL水混匀，于棕色瓶中保存备用。需每次使用前配制。

3.2.14      二水硫酸奎宁（C₂₀H₂₄N₂O₂×H₂SO₄×2H₂O）

3.2.15  硫酸溶液（0.05mol/L）：取2.8mL浓硫酸，缓慢加入适量水中，冷却后定容至1000mL。

3.2.16  荧光光度计校准溶液：称取3.40g硫酸奎宁（C₂₀H₂₄N₂O₂×H₂SO₄×2H₂O）用0.05 mol/L硫酸溶液稀释至100mL，此溶液荧光光度计读数相当于20 mg/L黄曲霉毒素标准溶液。

3.3 仪器和设备

3.3.1 荧光光度计

2.3.2 高速均质器：18,000 r/min ~22,000 r/min。

2.3.3 黄曲霉毒素免疫亲和柱。

2.3.4 玻璃纤维滤纸：直径11cm，孔径1.5μm。

2.3.5 玻璃注射器：10 mL，20mL。

2.3.6 玻璃试管：直径12 mm ，长75mm，无荧光特性。

2.3.7 空气压力泵。

3.4 分析步骤

3.4.1提取

同本标准2.4.1。

3.4.2 净化

同本标准2.4.2。

3.4.3测定

3.4.3.1    荧光光度计校准

    在激发波长360nm，发射波长450nm条件下，以0.05mol/L硫酸溶液为空白，调节荧光光度计的读数值为0.0 mg/L；以荧光光度计校准溶液（3.2.16）调节荧光光度计的读数值为20.0 mg/L。

3.4.3.2    样液测定

取上述净化后的甲醇洗脱液加入1.0mL 0.002%溴溶液，混匀，静置1min，按3.4.3.1条件进行操作，于荧光光度计中读取样液中黄曲霉毒素（B₁+B₂+G₁+G₂）的浓度 （mg/L）。

3.4.4空白试验

用水代替试样，按3.4.1~3.4.3步骤做空白试验。

3.4.5结果计算

检测结果按公式（2）计算：

                        …………（2）

式中： — 试样中黄曲霉毒素（B₁、B₂、G₁或G₂）含量，mg/kg；

      — 试样中黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁或G₂的含量，mg/L；

      — 空白试验黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁或G₂的含量，mg/L；

      — 最终甲醇洗脱液体积，mL；

      — 最终净化洗脱液所含的试样质量，g；

      — 试样称取量，g；

      — 样品和提取液总体积，mL；

      — 稀释用样品滤液体积，mL；

      — 稀释液体积，mL；

      — 通过亲和柱的样品提取液体积，mL。注：计算结果需扣除空白值。

        计算结果表示到小数点后1位。