LCMS／MS检测蜂蜜中的抗生素

在蜂箱中常使用抗生素来防止蜜蜂感染细菌性疾病，若蜂蜜中抗生素的残留量大，则会引起过敏反应和细菌的耐药性。通常应用LC-MS/MS定量检测蜂蜜中抗生素的残留，但样品制备耗时长，操作繁琐。本文建立了一种广泛适用的在线液相色谱（LC）方法，运用Aria TLX系统，对几类抗生素进行快速和全面的筛查。

建立筛查实验

应用LC-MS/MS定量检测蜂蜜中抗生素的残留，需经过调节pH值、水解、液液萃取、固相萃取、溶剂蒸发和预浓缩等繁琐的步骤。本文建立了一种广泛适用的自动化LC-MS/MS方法，来筛查蜂蜜中的多类抗生素。

实验方法

用含乙二胺四乙酸（EDTA）的缓冲溶液提取野花蜜中残留的几类典型的抗生素（大环内酯类、磺胺类、氨基糖苷类和四环素）。将两根TurboFlow柱（混合型阴离子交换柱和极性聚合柱）串联，采用TurboFlow方法对提取液进行净化。进样过程中，待分析的抗生素被保留在萃取柱上，而简单的糖类则直接被排到废液中。待测抗生素被有机溶剂洗脱至封端的硅胶基质混合型反相分析柱内，再经梯度洗脱进入TSQ Quantum Ultra三重四极杆质谱仪，采用加热电喷雾电离（H-ESI）和正离子选择性反应监测（SRM）模式检测。整个LC-MS/MS方法运行时间少于18min。正离子选择性反应监测（SRM）参数和其他质谱参数见表2。

样品制备

实验以野花蜜为检测样品，使用0.1mol/L EDTA-McIlvaine缓冲溶液对样品进行1:1的稀释。用甲醇:水溶液（3:1）配制磺胺吡啶、磺胺噻唑、替米考星、泰乐菌素、土霉素和红霉素的储备液，浓度为100μg/ml。另外，配制浓度为100μg/ml的多西环素、去甲金霉素，链霉素和双氢链霉素的水溶液。将这些储备液均加入到蜂蜜/缓冲溶液（1：1）的样品中，作为加标液来配制一系列标准溶液和质量控制样品（QCs）。所有空白、标准溶液和质量控制样品的配制和分析均使用聚丙烯样品瓶，进样体积为0.050ml。

Aria TLX-1: TurboFlow方法参数

TurboFlow Cyclone MAX与TurboFlow Cyclone-P柱（0.5mm×50mm）串联；BETASIL Phenyl/Hexyl柱：100mm×3mm，3μm。

上样流动相参数

流动相A：水，含1.0%甲酸；流动相B：乙腈，含1.0%甲酸；流动相C：10 mM乙酸铵的水溶液，pH=9；流动相D：甲醇，含10 mM乙酸铵和1.0%甲酸。

洗脱流动相

流动相A：水，含1 mM NFPA*、0.5% 甲酸和0.04% TFA**；流动相B：甲醇/乙腈（1:1），含0.5% 甲酸和0.04% TFA。注：*NFPA九氟戊酸；**TFA三氟乙酸。

结果与讨论

将分析结果打包输出，并将市售蜂蜜内少量内源型分析物作为背景值扣除，蜂蜜/缓冲溶液（1:1）中浓度为100ng/ml的10种待测抗生素的色谱图如图1所示。通过基体匹配校正可知：所有分析物的线性范围达两个数量级（r2＞0.99），所有分析物的定量下限的CV（n=3）值均小于19%，其他曲线点的CV（n=3）值均小于8%（见表3）。以土霉素为例，LCQUAN软件绘制的线性回归曲线如图2所示，对4个QC样品（浓度为2、50、100和500ng/ml）均平行处理和测定3次，考察QC样品的变异性。所有分析物的RSDs值均小于7%（除红霉素小于15%）。当QC样品中待测抗生素的浓度低于其定量下限时，得出的测定结果不被采用。

小结

在蜂蜜质量监测过程中，对不同类别的大量抗生素的检测一直较为困难，通常需要采用多重LC-MS方法进行检测。本实验首次应用了两根具有不同化学填料的在线TurboFlow萃取柱。结果显示，该方法的设计能够实现复杂的蜂蜜基体中所有典型抗生素的分离和定量检测。仅需加入缓冲溶液以减少样品粘度，缩短了样品处理的时间，能够迅速地对一个已知样品中的抗生素残留进行大范围筛查，从而提高样品检测通量。此外，方法结合Aria TLX-4系统，进一步将LC-MS/MS的总运行时间缩短至原来的1/4，每小时可筛查12个样品。