Microsart®AMP支原体试剂盒的验证测试

引言

作为世界上最小的细菌之一，支原体能够独立繁殖。它们属于柔膜菌纲，生长非常缓慢，且为寄生。细胞培养物的污染仍是一个主要问题。一系列生理和生化参数受细胞培养物中支原体的影响。支原体感染会导致细胞的代谢、生长、活力、大分子合成、形态等发生变化，因此对细胞培养物进行灵敏的常规污染检测是必不可少的。

传统的基于生长的方法需要培养至少28天才能确定地排除支原体污染。相比之下，核酸扩增技术（NAT）可将获得结果的时间缩短到几个小时。作为培养法的一种替代方法，必须证明NAT测试系统能够检测10 CFU/mL的支原体。为此，本研究中对三种不同的支原体PCR试剂盒进行了测试，测试其在DMEM培养基中检测不高于10 CFU/ml支原体的能力。

实验设置和结果

在本次研究中，使用Microsart® AMP支原体试剂盒（包括样品制备）和Microsart® AMP提取试剂盒（Sartorius Stedim Biotech GmbH）和其他两种支原体检测试剂盒进行了验证测试，这两种检测试剂盒也基于DNA分离和随后的实时荧光定量PCR分析。使用10CFU灵敏度标准精氨酸支原体（NCTC编号10129）、口腔支原体（NCTC编号10112）和柑橘螺原体（NCTC编号10164）（Sartorius Stedim Biotech GmbH）作为测试材料。这些冻干标准品可以通过加入1 ml样品基质轻松再水化，达到10 CFU/ml的浓度。这些制剂旨在用于安全可靠地对支原体PCR分析进行验证。在这些比较研究中，使用含有5% FCS的DMEM培养基作为样品基质。

对于全部三种测定，根据制造商的手册进行DNA分离过程和随后的PCR设定。Microsart® AMP提取试剂盒基于方便的二氧化硅柱方案，可在30分钟内完成。竞争产品的DNA分离基于磁珠法使DNA沉淀。在评估的三种PCR检测方法中，两种包括高度特异性的TaqMan探针；其中之一是Microsart® AMP支原体检测试剂盒。第三种检测方法的检测混合物中含有SYBR Green，使得在DNA扩增循环后需要进行融解曲线分析，以区分非特异性扩增DNA和支原体扩增DNA。

每种样品（精氨酸支原体、口腔支原体和柑橘螺原体）用每种试剂盒测试四次，包括DNA分离、聚合酶链式反应和数据分析的全过程。结果列于表1中。

表1：使用三家不同供应商的试剂盒对DMEM培养基 + 5% FCS和10 CFU/ml 精氨酸支原体|口腔支原体|柑橘螺原体进行PCR测试的结果

图 1：使用Microsart® AMP支原体试剂盒的扩增曲线，使用精氨酸支原体样品（10 CFU/ml，在DMEM培养基 + 5% FCS中），PCR Cycler MxPro 3005P

结论

在这些研究中，使用包括另外两家供应商支原体实时荧光定量PCR试剂盒（包括样品制备）对赛多利斯 Microsart® AMP提取试剂盒和Microsart® AMP支原体试剂盒进行了验证测试。

在随后的PCR分析中，36个DNA提取物均显示阳性信号。因此说明所有测试产品都能以至少10 CFU/ml的灵敏度检测支原体污染。

如果仔细观察一家供应商的结果中的标准偏差，首先使用Microsart® AMP提取试剂盒，然后用Microsart® AMP支原体试剂盒进行扩增，则会尽可能地减小结果的可变性，提高重现性。PCR试剂盒，主要是三种不同的样品制备方法可能导致出现重现性差异。已知二氧化硅膜方法即使在处理高度复杂的样品基质时也非常稳健和可靠。DNA沉淀法或磁珠法往往更费力且不可靠。

另一个有助于Microsart®支原体产品适用范围可靠性的事实是，所有PCR试剂都可以储存于4至8°C条件下。因此，如果冷链短暂中断，不会导致试剂发生融化，否则会对PCR检测的灵敏度产生负面影响。相反，供应商T和供应商R的支原体检测试剂盒必须在-20°C冷冻保存。当计划用这些产品进行测试时，必须记住PCR试剂解冻的额外等待时间。此外，必须考虑如果必须在-20°C储存的试剂盒在一次PCR运行中未完全用完，反复冻融也会对PCR结果产生负面影响。